Sonari†Alamat sonari: OX11 0DE, Inggris, Gedung Berlian, Taman Sains pakon Inovasi Harwell, Dietcote, Oxfordshire, Inggris, Sumber Cahaya Berlian Co., Ltd., Pusat Pencitraan Biologis Elektronik.
Pusat reaksi kompleks panen cahaya 1 (RC-LH1) aima komponen fotosintesis inti bakteri fototrofik ungu. Iperkenalhon hanami dua struktur mikroskop krio-elektron kompleks RC-LH1 humbani Rhodopseudomonas palustris. Struktur resolusi 2,65-Å kompleks RC-LH114-W terdiri humbani 14 loop subunit LH1 na manlinggomi RC, na iganggu protein W, sementara kompleks na lang marprotein-W aima komposisi RC na lengkap na ikelilingi RC. Itutup 16 subunit LH1 loop. Perbandingan struktur on mambere wawasan hubani dinamika quinone bani kompleks RC-LH1, termasuk perubahan konformasi na lape itontuhon sebelumni sanggah mengikat quinone i situs RC QB, sonai homa lokasi situs pengikatan quinone tambahan, na mangurupi Pass sidea hubani RC. Struktur na unik humbani protein W manlanglangi penutupan lingkaran LH1, sehingga mambahen saluran laho mempercepat pertukaran quinone/quinolone.
Energi na ibere fotosintesis boi patorsahon hampir haganup hagoluhan i tanoh on, anjaha bahat do potensini bani bioteknologi matahari. Sanggah mampromosihon fotosintesis global, bakteri fototrofik ungu pe pataridahkon bagei mode energi pakon kemampuan metabolisme. Boi do sidea menghindari fotosintesis pakon bertumbuh sebagai bakteri heterotrofik bani na golap, boi memperbaiki nitrogen pakon karbon dioksida, menghasilkan hidrogen, pakon mendegradasi senyawa aromatik (1-3). Ase boi mambere tenaga bani proses-proses on, panondang maningon do podas janah dear iubah gabe tenaga kimia. Proses on imulaini sanggah kompleks antena penjebak cahaya menyerap cahaya pakon mentransfer energi na terjebak hubani pusat reaksi (RC), sehingga mamungkah pemisahan muatan (4 – 7). Unit dasar fotosintesis bani bakteri fototrofik ungu terdiri humbani RC tipe 2, na ikelilingi kompleks panen cahaya 1 (LH1), na mambahen kompleks inti RC-LH1. LH1 ibentuk humbani susunan heterodimer αβ na melengkung, na masing-masing mangikat dua molekul klorofil bakteri (BChl) a pakon sada atap dua karotenoid (8-12). Antena LH1 na paling sederhana terdiri humbani 16 atap 17 αβ heterodimer na manlinggomi RC (9-13) ibagas lingkaran tertutup, tapi bani kompleks inti na legan, peptida transmembran mengganggu kontinuitas LH1 na i sekitarni, marhiteihonni ai mendorong difusi kinol/kinon antara RC pakon kompleks sitokrom bc (1111, 13). Suan-suanan fototrofik ungu Rhodopseudomonas (Rps.) aima sada organisme model na boi mangarusi energi pakon transfer elektron na mendukung fotosintesis. Struktur kristal na parlobei Rps. Model kompleks palustris RC-LH1 aima RC, na ikelilingi 15 lingkaran LH1 heterodimerik, na iganggu protein na lang binotoh na margoran “Protein W” (14). Protein-W i pudian ni ari itanda sebagai RPA4402, aima protein 10,5kDa na lape itandahon pakon tolu heliks transmembran (TMH) na iprediksi (16). Iusulhon hanami ase igantihon goran ni gen rpa4402 na mankodehon protein W gabe pufW ase sadalan hubani nomenklatur na ipakei bani gen na mankodehon subunit RC-L, M (pufL, pufM) pakon LH1α, β (pufA, pufB). Na menarik, protein-W pitah dong bani hira-hira 10% RC-LH1, na pataridahkon Rps. palustris manghasilhon dua kompleks RC-LH1 na berbeda. Ijon, ilaporhon hanami do struktur cryo-EM (cryo-EM) resolusi tinggi humbani dua kompleks inti, sada na marprotein W pakon 14 αβ heterodimer, na sada nari lang marprotein W pakon loop 16 Heterodimer LH1 na tertutup. Struktur nami manggambarhon sada perubahan langkah bani pangarusion kompleks RC-LH1 Rps. palustris, halani domma ipareksa hanami populasi na homogen humbani ganup varian pakon memiliki resolusi na cukup laho menetapkon secara jelas ganup peptida pakon pigmen na terikat pakon lipid pakon kinon na terkait. Bani perbandingan struktur on pataridahkon bahwa tolu protein TMH-W na lape ongga jumpah bani kompleks RC-LH1 na legan sadokah on mambahen saluran kinon laho mempercepat pertukaran kinon/kinon. Piga-piga situs pengikatan lipid pakon kinon na dob ikonservasi domma itanda, anjaha domma iungkapkon hanami perubahan konformasi na baru dobkonsi kombinasi kinon pakon RC, na mungkin cocok bani fotosistem II (PSII) RC ni organisme fototrofik na mar-oksigen. Hatorangan nami mambere wawasan na baru pasal kinetika pengikatan pakon pertukaran quinone/quinolone bani kompleks inti RC-LH1 bakteri fototrofik ungu.
Ase boi ipermudah sada penelitian na rinci pasal dua kompleks na jumpah i Rps. palustris, isolasi hanami do ganup RC-LH1 marhitei metode biokimia. Kompleks na hurang protein W (selanjutni isobut ΔpufW) imurnihkon humbani galur na lang dong gen pufW (16), anjaha pitah sada kompleks RC-LH1 do na boi iproduksi. Kompleks na marisi protein W iproduksi sada strain. Protein W humbani galur on iubah marhiteihon 10x His tag bani C-terminus ni, ase kompleks na marisi protein W boi ipadomu secara efektif pakon protein W na hurang marhitei na mambahen logam lang margerak. Kompleks ai domma ipisahkan secara efektif (16) Kromatografi Afinitas (IMAC).
Songon na taridah bani Gambar 1, haduasi kompleks ai marisi tolu sub-unit RC (RC-L, RC-M pakon RC-H) na i kelilingi antena LH1. Struktur 2.80-A humbani kompleks na lang dong protein-W pataridahkon 16 heterodimer αβ, na mambahen lingkaran LH1 na tertutup na manlinggomi RC, na isobut kompleks RC-LH116. Struktur 2,65Å humbani kompleks na marisi protein-W memiliki 14-heterodimer LH1 na iganggu protein-W, na isobut RC-LH114-W.
(A pakon B) Gambaran permukaan ni senyawa ai. (C pakon D) Pigmen na mardomu na iekspresihon bani batang. (E pakon F) Kompleks na iperhatihon humbani permukaan sitoplasma memiliki peptida pakon subunit LH1 na igambarkan bani kartun, pakon ibere nomor searah jarum jam humbani celah protein-W [konsisten pakon penomoran Rba. sphaeroides complex (13)]. Bani LH1-α, warna subunit protein aima kuning; bani LH1-β, warna subunit protein aima birong; bani protein-W, protein ai marwarna merah; bani RC-H, ai cyan; bani RC-L, ai ma warna Oranye; bani RC-M, magenta. Kofaktor igambarkan marhitei batang, hijau manggambarhon molekul BChl pakon BPh a, ungu manggambarhon karotenoid, pakon kuning manggambarhon molekul UQ10. (G pakon H) Pandangan na iperbesar humbani celah protein-W i daerah na sarupa pakon kompleks RC-LH114-W (G) pakon kompleks RC-LH116 (H). Kofaktor ipatuduh ibagas bentuk pengisian ruang, kinon kelat ipatuduh ibagas warna na birong. Celah protein-W isorot marhitei garis putus-putus na birong i (G), pakon lubang-lubang na etek ianan ni quinone/quinolol marserak bani cincin LH116 isorot marhitei garis putus-putus na hirang i (H).
Gambar 1 (A pakon B) pataridahkon RC na i kelilingi susunan heterodimer LH1αβ na terbuka atap tertutup, na masing-masing mengikat dua BChl pakon sada karotenoid (Gambar 1, C pakon D). Penelitian sebelumni domma patuduhkon bahwa Rps aima kompleks LH1. Bani jalur biosintesis spirulina xanthin, spesies on marisi populasi karotenoid na marcampur (17). Tapi, spiropyrroxanthin aima karotenoid na mendominasi janah kepadatanni memuaskan. Halani ai, ipilih hanami ma model spiroxanthin bani ganup ianan pengikatan LH1. Polipeptida alfa pakon beta aima TMH tunggal pakon daerah luar membran na pondok (Gambar 1, A, B, E, pakon F). Hassi pe lang ididah kepadatan 17 residu i C-terminus, polipeptida alfa ibagi humbani Met1 das hubani Ala46 bani kedua kompleks ai. β polipeptida iurangi humbani Gly4 gabe Tyr52 bani RC-LH116, pakon humbani Ser5 gabe Tyr52 bani RC-LH114-W. Lang dong kepadatan 3 atap 4 residu N-terminal atap 13 C-terminal na ididah (Gambar S1). Analisis spektrometri massa kompleks RC-LH1 campuran na ipasirsir humbani strain tipe liar pataridahkon bahwa daerah na magou aima hasil pembelahan heterolog peptida on (Gambar S1 pakon S2). Formilasi N-terminal α-Met1 pe ididah (f). Analisis ai pataridahkon bahwa α-peptida terdiri humbani residu fMet1 das hubani Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, pakon β-peptida terdiri humbani residu Ser2 das hubani Ala53, na sadalan hubani peta kepadatan EM suhu rendah.
Koordinasi α-His29 pakon β-His36 mambahen BChls pajumpah; ganup αβ heterodimer martumpu pakon tetanggani laho mambahen lingkaran terbuka (RC-LH114-W) atap lingkaran tertutup (RC-LH116) i sekitar RC Array pigmen na ipasang eksiton (Gambar 1, C pakon D). Ibandingkon pakon pita 877 nm RC-LH114-W, pergeseran merah penyerapan 880 nm RC-LH116 aima 3 nm (Gambar 2A). Tapi, spektrum dikroisme lingkaran hampir dos (Gambar 2B), na pataridahkon pori pe dong perbedaan na jelas antara lingkaran terbuka pakon tertutup, lingkungan lokal BChls sarupa tumang. Pergeseran merah penyerapan mungkin hasil humbani gerak termal na berkurang pakon peningkatan stabilitas bani lingkaran tertutup (18, 19), perubahan kopling pigmen na ibahen lingkaran tertutup (20, 21), atap kombinasi humbani dua efek on (11).
(A) Spektrum penyerapan ultraviolet/taridah/inframerah na dohor, puncakni itandai pakon pigmen na sadalan pakon inormalhon hubani puncak BPh bani 775 nm. (B) Spektrum dikroisme lingkaran na inormalhon hubani absorbansi BChl bani 805 nm. (C pakon D) Spektrum ΔA na ipilih humbani spektrum penyerapan na dob isolsoli bani panorang humbani kompleks RC-LH114-W (C) pakon kompleks RC-LH116 (D). Ase lambin dear perbandinganni, haganup spektrum inormalhon hubani ∆A humbani −A bani 0,2 ps. (E) Tingkat oksidasi sitokrom c2 dob iradiasi bani kehadiran berbagai konsentrasi UQ2 (idah Gambar S8 untuk data mentah). (F) Bani sel na tubuh i toruh ni panondang na mar-intensitas rendah, menengah atap tinggi (10, 30 atap 300μMm-2 s-1, masing-masing), subunit protein W pakon RC-L bani kompleks na dob imurnihkon pakon rasio membran na dob ipisahkon. Manontuhon tingkat protein marhiteihon elektroforesis gel SDS-poliakrilamida pakon imunoassay (idah Gambar S9 untuk data mentah). Tontuhon ma rasio relatif hubani kompleks RC-LH114-W na dob imurnihkon. Rasio stoikiometri RC-L hubani protein-W kompleks aima 1:1.
BChls bani posisi 1 bani lingkaran αβ14 na cacat RC-LH114-W (Gambar 1, A, C, pakon E) dohor do hubani donor primer RC (P) 6,8Å marimbang BChls na sarupa bani RC-LH116 (Gambar 1, B, D, pakon F, pakon S3); age pe sonai, kinetika penyerapan sementara humbani dua kompleks ai pataridahkon bahwa bani RC-LH114-W pakon RC-LH116, konstanta waktu transfer energi eksitasi humbani LH1 hubani RC aima 40 ±4 pakon 44±3 ps (Gambar 2). , C pakon D, Gambar S4 pakon Tabel S2). Lang dong homa perbedaan na signifikan bani transfer elektronik ibagas RC (Gambar S5 pakon teks tambahan na terkait). Icurigai hanami bahwa korespondensi na dohor bani panorang transfer energi antara LH1 pakon RC-P aima halani jarak, sudut pakon energi potensial na sarupa humbani sebagian besar BChl bani dua lingkaran LH1. Songon na manjelajahi pola energi LH1 laho das hubani jarak minimum lang lobih doras marimbangkon transfer energi langsung humbani ianan na lang optimal hu RC. Loop LH1 open-loop bani RC-LH114-W boi do homa mengalami gerakan termal na lang signifikan bani kondisi suhu na rendah untuk analisis struktural, pakon dong konformasi cincin αβ14 na lobih ganjang bani suhu kamar humbani jarak pigmentasi βBChls bani posisi RC 1.
Kompleks RC-LH116 marisi 32 BChls pakon 16 karotenoid, anjaha susunanni secara keseluruhan dos do pakon na dapot humbani Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) strain DB (PDB07) (IDC) (297) pakon ganggang hijau (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Dobkonsi sejajar, pitah penyimpangan na etek bani posisi αβ heterodimer do na ididah, tarlobih 1-5, 15, pakon 16 (Gambar S6). Hadirion ni protein-W marpangkorhon na signifikan hubani struktur LH1. Tolu TMH-ni ihubungkon marhitei loop na pondok, pakon N-terminal i sisi lumen kompleks pakon C-terminal i sisi sitoplasma (Gambar 1A pakon 3, A das hubani D). Protein-W sebagian besar hidrofobik (Gambar 3B), pakon TMH2 pakon TMH3 berinteraksi pakon LH1αβ-14 laho mambahen permukaan transmembran (Gambar 3, B pakon E das hubani G). Antarmuka ai terutama terdiri humbani residu Phe, Leu pakon Val i daerah transmembran. Sisa-sisa on isusun pakon asam amino hidrofobik pakon pigmen αβ-14. Piga-piga residu polar pe berkontribusi hubani interaksi, termasuk ikatan hidrogen antara W-Thr68 pakon β-Trp42 i permukaan rongga kompleks (Gambar 3, F pakon G). Bani permukaan sitoplasma, Gln34 berdekatan pakon kelompok keto karotenoid αβ-14. Leganni ai, molekul n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) domma isolsoli, anjaha ihur hidrofobikni iperpanjang das hubani antarmuka antara protein-W pakon αβ-14, anjaha ihur lipid ai boi do marianan i bagas angkula. Ipardiateihon hanami do homa anggo daerah resolusi C-terminal ni protein W pakon RCH dohor tumang, tapi lang ibagas lingkup pembentukan interaksi na khusus (Gambar 1, A pakon E). Tapi, ra do adong interaksi bani asam amino C-terminal na lape salosei humbani dua protein on, na boi mambere mekanisme perekrutan protein-W sanggah perakitan kompleks RC-LH114-W.
(A) Protein-W, na mandompakkon antarmuka pakon LH1αβ14 ibagas bentuk kartun, memiliki rantai samping berbentuk batang (merah), na ipatuduh bani bagian diagram potensial elektrostatik (permukaan abu-abu transparan dengan tingkat kontur 0,13). (B) Protein-W na igambarkan marhiteihon permukaan na marwarna hidrofobik. Daerah polar pakon bermuatan ipatuduh ibagas warna cyan, daerah hidrofobik ipatuduh ibagas warna putih, pakon daerah hidrofobik na kuat ipatuduh ibagas warna oranye. (C pakon D) Protein-W na igambarkan bani kartun, orientasini dos songon na bani (A) (C), anjaha iputar 180° (D). Domu hubani posisi bani urutan, residu na boi ibedakan mengadopsi skema warna pelangi, ija N-terminal marwarna birong pakon C-terminal marwarna merah. (E) Protein-W bani pandangan na sarupa songon bani (A), pakon residu-residu na adong bani antarmuka protein-W:LH1 igambarkan marhitei batang-batang na martanda na ipasang. (F) Protein-W iputar 90° relatif hubani (E) pakon LH1αβ14 bani gambaran kartun, pakon relatif hubani residu antarmuka bani gambaran batang. Sisa-sisa na manjulur humbani polipeptida beta ibere label. Kofaktor ipatuduh songon batang na sosok pakon warna Gambar 1, β-DDM na dob terurai ipatuduh marwarna abu-abu, pakon oksigen ipatuduh marwarna merah. (G) Pandangan bani (F) iputar 180°, pakon sisa-sisa na menonjol humbani polipeptida alfa na marlabel.
Protein-W manggantihkon heterodimer αβ (na pa-15-hon bani Gambar 1F), marhiteihon ai manlanglangi penutupan lingkaran pakon memiringkan tolu heterodimer αβ na parlobei. Ipardiateihon do sudut kemiringan maksimal heterodimer αβ-1 na parlobei relatif hubani film normal aima 25° ronsi 29° (Gambar 1, A pakon E), na ibentuk humbani kemiringan 2° ronsi 8° αβ-1 bani RC A kontras tajam-LH116 (Gambar 1, B pakon F). Heterodimer paduahon pakon patoluhon miring 12° das hubani 22° pakon 5° das hubani 10°, masing-masing. Halani hambatan sterik RC, kemiringan αβ-1 lang termasuk pasangan αβ paduahon (na sadalan hubani αβ pa-16-hon bani Gambar 1F), sehingga mambahen celah na jelas bani cincin LH1 (Gambar 1, A pakon E) . Halani hurangni dua heterodimer αβ, na isertai pakon magou ni ompat BChl pakon dua karotenoid, lang dong karotenoid na mangikat subunit αβ-1 na marputar, na mambahen sada cincin LH114-W na marisi 13 karotenoid Vegetarian pakon 28 BChls. Perkiraan resolusi lokal humbani dua kompleks i αβ1 ronsi 7 daerah lobih rendah marimbang sisa ni lingkaran LH1, na boi mencerminhon plastisitas na melekat bani subunit LH1 na berdekatan pakon situs RC QB (Gambar 4) .
Gambar RC-LH114-W (A pakon B) pakon RC-LH116 (C pakon D) ipatuduh humbani pandangan atas/pandangan samping (A pakon B) (A pakon C) pakon permukaan rongga Gambar 1. (B pakon D). Tombol na marwarna ipatuduh i siamun.
Sada-sadani kompleks inti na legan na marrasio stoikiometri 1:14 aima Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX dimer (13). Tapi, protein W pakon PufX lang dong homologi na jelas, anjaha marpangkorhon na signifikan bani struktur LH1 ni bei. PufX aima sada TMH pakon domain sitoplasma N-terminal na berinteraksi pakon sisi sitoplasma subunit RC-H (13) bani posisi na sadalan hubani Rps. palustris LH116αβ-16. PufX mambahen sada saluran untuk pertukaran kinon/kinolon antara RC-LH1 pakon kompleks sitokrom bcl janah adong bani ganup Rba. kompleks inti sphaeroides (13). Hassi pe antarmuka monomer-monomer aima i Rba. Dimer sphaeroides RC-LH1-PufX marianan bani posisi pengikatan protein W i RC-LH114-W, pakon celah na ibahen PufX pakon protein-W marianan bani posisi na sarupa (Gambar S7A). Celah i RC-LH114-W sejajar do homa pakon saluran kinon hipotetis (8) Pseudomonas rosea LH1, na ibentuk peptida na lang marpardomuan hubani protein W atap PufX (Gambar S7B). Leganni ai, saluran kinon i Blc. LH1 na marwarna hijau zamrud na ibentuk marhitei na lang dihutkon sada subunit γ (7) marianan bani posisi na sarupa (Gambar S7C). Hassi pe imediasi protein na berbeda, penampilan saluran kinon/kinolol on bani posisi na sarupa bani kompleks RC-LH1 songon contoh evolusi konvergen, na pataridahkon bahwa celah na ibahen protein W boi bertindak sebagai saluran kinon.
Celah bani lingkaran LH114-W mambahen terbentuk daerah membran na berkelanjutan antara ruang internal kompleks RC-LH114-W pakon membran massal (Gambar 1G), sedo na manghubungkon dua domain ai marhitei pori protein songon bani protein. Kompleks RC-LH116 mirip pakon Tch na tertutup. Kompleks songon jarum (22) (Gambar 1H). Halani difusi quinone marhitei membran lobih doras marimbang difusi marhitei saluran protein na sompit, lingkaran LH114-W na terbuka boi mambahen perputaran RC lobih doras marimbang lingkaran LH116 na tertutup, pakon difusi quinone hu RC boi do lobih terbatas. Ase boi manguji atap na protein W do na mambahen pengaruh hubani konversi kinon marhitei RC, ibahen hanami ma assay oksidasi sitokrom bani konsentrasi tertentu ubiquinone 2 (UQ2) (analog UQ10 alami pakon ikur isoprene na pondok) (Gambar 2E). Hassi pe kehadiran quinone chelated menghambat penentuan akurat konstanta Michaelis na taridah (RC-LH114-W pakon RC-LH116 cocok bani 0,2±0,1μM pakon 0,5±0,2μM, masing-masing), tingkat maksimum RC-LH114-W ( 4,6±0,20,2μM) aima s-LH114-W. 28±5% lobih banggal humbani RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1).
Bani mungkahni iperkirahon hanami bahwa protein-W adong bani hira-hira 10% kompleks inti (16); ijon, tingkat penghunian sel pertumbuhan na rendah cahaya, menengah, pakon tinggi cahaya aima 15±0,6%, 11±1% pakon 0,9±0,5, masing-masing % (Gambar 2F). Perbandingan kuantitatif spektrometri massa pataridahkon bahwa penambahan tag histidin lang mangurangi kelimpahan relatif protein-W ibandingkon hubani strain tipe liar (P = 0,59), jadi tingkat on lang artefak protein-W na imodifikasi (Gambar S10). Tapi, penghunian protein-W na rendah on bani kompleks RC-LH1 boi mambahen piga-piga RC boi marbalik bani kecepatan na ipercepat, sehingga meringankan pertukaran quinone/quinolone na lambat bani kompleks RC-LH116. Ipardiateihon hanami bahwa tingkat penghunian cahaya na gijang lang sadalan hubani data transkriptomik baru-baru on, na pataridahkon bahwa ekspresi gen pufW meningkat i toruh ni cahaya na gogoh (Gambar S11) (23). Perbedaan antara transkripsi pufW pakon penggabungan protein-W hubagas kompleks RC-LH1 mambahen bingung janah boi mencerminhon pengaturan kompleks protein.
Bani RC-LH114-W, 6 kardiolipin (CDL), 7 fosfatidilkolin (POPC), 1 fosfatidilgliserol (POPG) pakon 29 molekul β-DDM ialokasihon janah imodelhon ibagas ai 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG pakon 21βD. RC-LH116 (Gambar 5, A pakon B). Bani dua struktur on, CDL hampir marianan i sisi sitoplasma kompleks, sementara POPC, POPG pakon β-DDM bahatan marianan i sisi luminal. Dua molekul lipid pakon deterjen isolasi i daerah αβ-1 ronsi αβ-6 kompleks RC-LH114-W (Gambar 5A), pakon lima isolasi i daerah setara RC-LH116 (Gambar 5B ). Legan do lipid na jumpah i sisi na legan ni kompleks ai, tarlobih CDL, na martumpu antara RC pakon αβ-7 das hubani αβ-13 (Gambar 5, A pakon B). Lipid pakon deterjen na legan na dob isolsoli secara struktural marianan i luar cincin LH1, pakon rantai asil na dob isolsoli dear manjulur antara subunit LH1, na itontuhon sebagai β-DDM bani RC-LH114-W, pakon iartihon sebagai β-DDM bani RC A campuran β-DDM pakon PO-LH116. Posisi na sarupa humbani lipid kelating pakon deterjen bani struktur nami pataridahkon bahwa sidea aima situs pengikatan na relevan secara fisiologis (Gambar S12A). Posisi molekul na sarupa bani Tch pe dear do konsistensi ni. Lembut pakon Trv. Galur 970 RC-LH1s (Gambar S12, B das hubani E) (9, 12) pakon residu ikatan hidrogen humbani kelompok ulu lipid pataridahkon konservasi na cukup dear bani keselarasan urutan (Gambar S13), na pataridahkon anggo CDL na ilestarihon na mengikat RC (24), situs-situs on boi do ikonservasi bani kompleks RCH-LH1.
(A pakon B) Peptida RC-LH114-W (A) pakon RC-LH116 (B) igambarkan marhitei kartun, pakon pigmen igambarkan marhitei batang, mamakei skema warna bani Gambar 1. Lipid ipatuduh marwarna merah, pakon deterjen ipatuduh marwarna abu-abu. UQ na terikat hubani RC QA pakon QB situs marwarna kuning, sementara UQ na terisolasi marwarna birong. (C pakon D) Pandangan na sarupa pakon (A) pakon (B), lang dong lipid. (E das hubani G) Pandangan na iperbesar humbani Q1(E), Q2(F) pakon Q3(G) humbani RC-LH116, pakon rantai samping na saling mempengaruhi. Ikatan hidrogen ipatuduh songon garis putus-putus na hirang.
Bani RC-LH116, RC QA pakon QB UQ, na dihut bani transfer elektron bani proses pemisahan muatan, terurai bani ianan pengikatan ni sidea. Tapi, bani RC-LH114-W, QB quinone lape salosei janah iulas secara rinci i toruh on. Leganni QA pakon QB quinones, dua molekul UQ na markelat (na marianan i holang-holang ni cincin RC pakon LH1) ialokasihon bani struktur RC-LH114-W domu hubani kelompok ulu na dob dear (na marianan i Q1 pakon Q2, masing-masing). kamar). Gambar 5C). Dua unit isoprene itetapkon hubani Q1, pakon peta kepadatan pasaloseihon 10 ikur isoprene na lengkap humbani Q2. Bani struktur RC-LH116, tolu molekul UQ10 na ikelat (Q1 ronsi Q3, Gambar 5D) domma isolsoli, anjaha haganup molekul memiliki kepadatan na jelas i sab ihur (Gambar 5, D ronsi G). Bani dua struktur ai, posisi kelompok ulu quinone Q1 pakon Q2 memiliki konsistensi na sangat baik (Gambar S12F), anjaha sidea pitah berinteraksi pakon RC. Q1 marianan i pintu masuk celah W RC-LH114-W (Gambar 1G pakon 5, C, D pakon E), anjaha Q2 marianan dohorhon ianan pengikatan QB (Gambar 5, C, D) pakon F). Residu L-Trp143 pakon L-Trp269 na ikonservasi dohor tumang hubani Q1 pakon Q2 pakon mambere interaksi π-stacking na berpotensi (Gambar 5, E pakon F, pakon Gambar S12). L-Gln88, 3.0 Å humbani oksigen distal Q1, mambere ikatan hidrogen na toguh (Gambar 5E); residu on ikonservasi bani haganup RC kecuali hubungan na paling daoh (Gambar S13). L-Ser91 secara konservatif igantihkon Thr bani bueinan RC na legan (Gambar S13), aima 3,8 Angstrom humbani metil oksigen Q1, pakon boi mambere ikatan hidrogen na galek (Gambar 5E). Q3 lang taridah dong interaksi na khusus, tapi marianan i daerah hidrofobik antara subunit RC-M pakon subunit LH1-α 5 ronsi 6 (Gambar 5, D pakon G). Q1, Q2 pakon Q3 atap kinon kelat na dohor domma homa isolsoli i Tch. Lembut, Trv. Strain 970 pakon Blc. Struktur iris (9, 10, 12) menunjuk hubani situs pengikatan kinon bantu na terkonservasi bani kompleks RC-LH1 (Gambar S12G). Lima UQ na dob busuk i RC-LH116 dear do sadalan pakon 5,8±0,7 humbani ganup kompleks na itontuhon marhitei kromatografi cair berkinerja tinggi (HPLC), sementara tolu UQ na dob busuk i RC-LH114-W itoruh ni Nilai na isukat 6,2±0,3 (Gbr. S14) pataridahkon na lang dong molekul UQ na menyelesaikan. susunan.
Polipeptida L pakon M pseudo-simetris masing-masing marisi lima TMH pakon mambahen sada heterodimer na padomuhon sada dimer BChl, dua monomer BChl, dua monomer bakteriofag (BPh), pakon sada besi non-Heme pakon sada atap dua molekul UQ10. Marhiteihon ikatan hidrogen bani gugus keton terminal pakon akumulasi na dob ibotoh bani Rps, karotenoid ipamasuk hu M-subunit, na margoran cis-3,4-dehydroorhodopin. Spesies (25). Domain membran luar RC-H ipasang bani membran marhitei sada TMH. Struktur RC secara keseluruhan sarupa pakon tolu subunit RC humbani spesies na markaitan (misalni Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). Siklus makro BChl pakon BPh, tulang punggung karotenoid pakon besi non-heme tumpang tindih ibagas rentang resolusi struktur on, sonai homa kelompok ulu UQ10 i situs QA pakon kinon QB i RC-LH116 (Gambar S15).
Ketersediaan dua struktur RC na berbeda tingkat penghunian situs QB mambere kesempatan na baru laho mamareksa perubahan konformasional na konsisten na mangiringkon pengikatan quinone QB. Bani kompleks RC-LH116, QB quinone marianan bani posisi “proksimal” na gok terikat (26), tapi pemisahan RC-LH114-W lang dong QB quinone. Lang dong QB quinone bani RC-LH114-W, na mambahen tarsonggot halani kompleks ai aktif, lobih humbani kompleks RC-LH116 na mar-QB quinone na dob isolsoli secara struktural. Hassi pe dua cincin LH1 ai markelat hira-hira onom kinon, lima do na terselesaikan secara struktural bani cincin RC-LH116 na tertutup, sementara pitah tolu do na terbatas secara struktural bani cincin RC-LH114-W na terbuka. Gangguan struktural na lambin banggal on boi do mencerminhon penggantian situs QB RC-LH114-W na lambin podas, kinetika quinone na lambin podas i kompleks, pakon kemungkinan na lambin banggal laho manlewati lingkaran LH1. Hanami mangusulhon ase hurangni UQ bani situs RC QB RC-LH114-W mungkin hasil humbani kompleks na lobih kompleks pakon lobih aktif, pakon situs QB RC-LH114-W domma mintor beku bani pergantian UQ Tahap khusus (pintu masuk hu situs QB domma itutup) mencerminhon konformasi aktivitas on.
Anggo lang dong QB, rotasi na mangiringkon L-Phe217 hubani posisi na lang sosok pakon pengikatan UQ10, halani ai mambahen tabrakan spasial pakon unit isoprene na parlobei i ihur (Gambar 6A). Leganni ai, parubahan konformasional utama na jelas jelas, tarlobih heliks de (heliks pondok bani lingkaran antara TMH D pakon E) ija L-Phe217 ipindahi hu kantong pengikatan QB pakon rotasi L-Tyr223 (Gambar 6A) Laho mamutuskon ikatan hidrogen pakon kerangka pengikatan M-A4 pakon manutup pintu pengikatan QB ianan (Gambar 6B). Helix de berputar i dasarni, Cα ni L-Ser209 bergeser 0,33Å, sementara L-Val221Cα bergeser 3,52Å. Lang dong parubahan na boi iperhatihon bani TMH D pakon E, na boi i superimpose bani kedua struktur ai (Gambar 6A). Sadokah na ibotoh hanami, on ma struktur na parlobei i RC alami na manutup situs QB. Bani perbandingan pakon struktur na lengkap (QB-bound) pataridahkon paima quinone ai iurangi, porlu do perubahan konformasi ase boi masuk hu quinone. L-Phe217 marputar laho mambahen interaksi π-stacking pakon kelompok ulu quinone, pakon heliks bergeser hu darat, na mambahen kerangka L-Gly222 pakon rantai samping L-Tyr223 mambahen jaringan ikatan hidrogen pakon struktur ikatan hidrogen na stabil (Gambar 6, A pakon C).
(A) Kartun tumpang tindih hologram (rantai L, rantai oranye/M, magenta) pakon struktur apo (abu-abu), ija residu kunci ipatuduh ibagas bentuk representasi songon batang. UQ10 igambarkan marhiteihon garis kuning. Garis titik-titik pataridahkon ikatan hidrogen na terbentuk bani ganup struktur. (B pakon C) Representasi permukaan apolipoprotein pakon struktur cincin na gok, na pataridahkon oksigen rantai samping L-Phe217 marwarna birong pakon L-Tyr223 marwarna merah, masing-masing. Subunit L marwarna oranye; subunit M pakon H lang marwarna. (D pakon E) Apolipoprotein (D) pakon ganup (E) situs RC QB [warna marhitei (A) masing-masing] pakon Thermophilus thermophilus PSII (hijau, birong pakon kinon plastik; PDB ID: 3WU2) Sejajar (58).
Lang isangka, pori pe dong piga-piga struktur RC na hurang QB tanpa LH1, perubahan konformasional na ididah bani penelitian on lape ongga ilaporhon. On ma na tarmasuk struktur deplesi QB humbani Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) pakon Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), haganupan ai hampir dos pakon struktur QB ni sidea secara keseluruhan. Pemeriksaan dekat 3PRC mangungkapkon bahwa molekul deterjen LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) mengikat i pintu masuk posisi QB, na boi mencegah pengaturan kembali gabe konformasi tertutup. Hassi pe LDAO lang terurai bani posisi na sarupa i 1EYS atap 1OGV, RC on ipasirsir mamakei deterjen na sarupa halani ai boi do homa mambahen efek na sarupa. Struktur kristal ni Rba. Sphaeroides RC na ikristalhon rap pakon sitokrom c2 (PDB ID: 1L9B) songon na dong do homa situs QB na tertutup. Tapi, bani kasus on, daerah N-terminal polipeptida RC-M (berinteraksi pakon situs pengikatan QB melalui ikatan H residu Tyr pada heliks Q) mengadopsi konformasi yang tidak alami, dan perubahan konformasi QB tidak dijelajahi lebih lanjut (30 ). Na mambahen tenang aima anggo hanami lape ongga mangidah deformasi polipeptida M na songon on bani struktur RC-LH114-W, na hampir dos pakon daerah N-terminal RC-LH116 RC. Porlu do homa ibotoh hita dob ipadaoh antena LH1 na mardasarhon deterjen, RC apolipoprotein i PDB domma isolsoli, na mambahen magou kolam kinon internal pakon lipid i celah antara RC pakon permukaan parbagas ni cincin LH1 na i sekitarni (31, 32). RC totap marfungsi halani totap do ia manramotkon haganup kofaktor, kecuali QB quinone na boi iurai, na lang stabil janah gati magou sanggah proses persiapan (33). Leganni ai, ibotoh do anggo penghapusan LH1 pakon lipid siklik alami humbani RC boi do berdampak hubani fungsi, misalni umur na ipersingkat humbani P+QB-state na ipisahkon muatan (31, 34, 35). Halani ai, hanami marsangka bahwa keberadaan cincin LH1 lokal na manlinggomi RC boi do mampartahankon situs QB na “tertutup”, sehingga boi manramotkon lingkungan lokal na dohor bani QB.
Hassi pe apolipoprotein (lang dong QB quinone) pakon struktur na lengkap pitah mewakili dua jepretan pergantian situs QB, sedo serangkaian peristiwa, dong indikasi bahwa pengikatan ai boi i gerbang laho mancegah pengikatan ulang oleh hidrokinon Laho menghambat penghambatan substrat. Interaksi quinolol pakon quinone i dohorhon situs QB ni apolipoprotein boi do berbeda, na mambahen penolakan ni RC. Domma dokah iusulhon bahwa parubahan konformasi berperan bani pengikatan pakon pengurangan quinones. Kemampuan RC beku laho mangurangi quinones dobkonsi adaptasi golap terganggu (36); Kristalografi sinar-X pataridahkon anggo hasedaon on halani QB quinones na terjebak bani konformasi “distal” hira-hira 4,5 Å humbani posisi proksimal aktif (26) , 37). Iusulhon hanami ase konformasi pengikatan distal on aima gambaran keadaan perantara antara apolipoprotein pakon struktur cincin penuh, na mangihutkon interaksi awal pakon quinone pakon pembukaan situs QB.
RC tipe II na jumpah bani kompleks PSII humbani bakteri fototrofik tertentu pakon cyanobacteria, ganggang pakon suan-suanan memiliki konservasi struktural pakon fungsional (38). Keselarasan struktural na ipatuduh bani Gambar 6 (D pakon E) menekanhon kesamaan antara PSII RCs pakon situs QB kompleks RC bakteri. Parbandingan on domma dokah gabe model laho mamparlajari sistem pengikatan pakon reduksi kinon na dohor. Publikasi sebelumni patugahkon bahwa perubahan konformasional ihasomani pengurangan PSII quinones (39, 40). Halani ai, mangidah konservasi evolusioner RC, mekanisme pengikatan na lape ongga ididah on boi do homa berlaku bani situs QB PSII RC bani suan-suanan fototrofik na mar-oksigen.
Rps ΔpufW (penghapusan pufW na lang marlabel) pakon PufW-His (C-terminal 10x His-tagged protein-W na iekspresihon humbani lokus pufW alami) strain. palustris CGA009 domma ipatugah bani horja nami sebelumni (16). Strain on pakon induk tipe liar isogenik ibuat humbani freezer marhitei na mangoriskon piga-piga sel bani PYE (masing-masing 5 g liter -1) (isimpan i LB bani -80 °C, marisi 50% ( w/v) gliserol) protein, ekstrak ragi pakon suksinat) agar [1,5%/v) piring. Pinggan ai i inkubasi saborngin ibagas na golap bani suhu kamar ibagas kondisi anaerobik, dob ai iterangi marhiteihon panondang putih (~50 μmolm-2 s-1) na ibere bohlam halogen OSRAM 116-W (RS Components, UK) sadokah 3 ronsi 5 ari ronsi taridah sada koloni. Sada koloni ipakei laho manginokulasi 10 ml media M22+ (41) na itambahi 0,1% (w/v) asam casamino (selanjutni isobut M22). Budaya ai iparbuahkon ibagas kondisi oksigen na rendah ibagas na golap bani suhu 34°C marhitei na igoyang-goyang bani 180 rpm sadokah 48 jam, dob ai 70 ml kultur ai iinokulasihon ibagas kondisi na sarupa sadokah 24 jam. Kultur semi-aerobik na marvolume 1 ml ipakei laho manginokulasi 30 ml media M22 ibagas botol kaca transparan 30 ml sekrup-atas universal janah iradiasi marhitei agitasi (~50μmolm-2 s-1) sadokah 48 jam marhitei gaya magnet steril Stirring rod. Dob ai 30 ml kultur ai i inokulasihon pakon hira-hira 1 liter kultur bani kondisi na sarupa, na dob ai ipakei laho maninokulasi hira-hira 9 liter kultur na isinalsal bani ~200 μmolm-2 s-1 sadokah 72 jam. Sel-sel ai ipanen marhitei sentrifugasi bani 7132 RCF sadokah 30 menit, isuspensihon use ibagas ~10 ml 20 mM tris-HCl (pH 8,0), anjaha isimpan bani -20°C ronsi porlu.
Dob icairhon, tambahkon ma piga-piga kristal deoksiribonuklease I (Merck, Inggris), lisozim (Merck, Inggris) pakon dua tablet penghambat protease holoenzim Roche (Merck, Inggris) hubani sel na dob isuspensihon use. Bani sel tekanan Perancis 20.000 psi (Aminco, AS), sel-sel ai terganggu 8 ronsi 12 hali. Dob ipadaoh sel na lang putus pakon sisa-sisa na lang larut marhitei sentrifugasi bani 18.500 RCF sadokah 15 menit bani 4°C, membran ai iendapkon humbani lisat na marpigmen marhitei sentrifugasi bani 113.000 RCF sadokah 2 jam bani 43.000°C. Buang ma fraksi na larut ai janah isuspensihon ma use membran na marwarna ai ibagas 100 ronsi 200 ml 20 mM tris-HCl (pH 8,0) janah homogenhon ma ronsi lang dong be agregat na taridah. Membran na isuspensihon i inkubasi ibagas 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, USA) na marisi 2% (w/v) β-DDM sadokah 1 jam ibagas na golap bani suhu 4°C marhiteihon pengadukan lembut. Dob ai sentrifugasi bani 70°C laho melarutkon 150.000 RCF bani 4°C sadokah 1 jam laho padaohkon sisa-sisa na lang larut.
Membran solubilisasi humbani strain ΔpufW iterapkon hubani kolom pertukaran ion DEAE Sepharose 50 ml pakon tolu volume kolom (CV) penyangga pengikat [20 mM tris-HCl (pH 8,0) na marisi 0,03% (w / v) β-DDM]. Burihi ma kolom ai marhitei dua penyangga pengikat CV, dob ai burihi ma kolom ai marhitei dua penyangga pengikat na marisi 50 mM NaCl. Kompleks RC-LH116 ielusi marhiteihon gradien linier 150 ronsi 300 mM NaCl (ibagas penyangga pengikatan) bani 1,75 CV, anjaha kompleks pengikat na tading ieluasi marhiteihon penyangga pengikat na marisi 300 mM NaCl bani 0,5 CV. Patumpu ma spektrum penyerapan antara 250 pakon 1000 nm, jaga ma fraksi na marrasio penyerapan (A880/A280) lobih humbani 1 bani 880 ronsi 280 nm, encerhon ma ai dua hali bani penyangga pengikat, dob ai pakei ma use prosedur na sarupa bani kolom DEAE On pemurnian. Encerhon ma pecahan-pecahan na marrasio A880/A280 lobih humbani 1,7 pakon rasio A880/A805 lobih humbani 3,0, bahen ma putaran patoluhon pertukaran ion, anjaha tahan ma pecahan-pecahan na marrasio A880/A280 lobih humbani 2,2 pakon rasio A880/A805 lobih humbani 0,05. Kompleks na dob imurnihkon sebagian ikonsentrasihon das hubani ~2 ml bani filter sentrifugal Amicon 100.000 molecular weight cut-off (MWCO) (Merck, UK), anjaha iisi bani kolom pengecualian ukuran Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, US) na marisi 200 mM penyangga NaCl, dob ai ielusi bani penyangga na sarupa. CV. Patumpu ma spektrum penyerapan humbani fraksi pengecualian ukuran, anjaha konsentrasihon ma spektrum penyerapan ai marhitei rasio A880/A280 lobih humbani 2,4 pakon rasio A880/A805 lobih humbani 5,8 ronsi 100 A880, anjaha mintor pakei ma ai laho pasirsirhon kisi-kisi cryo-TEM atap pe penyimpanan Simpan ma bani -80°C ronsi porlu.
Membran solubilisasi humbani galur PufW-His iterapkon hubani kolom HisPrep FF Ni-NTA Sepharose 20 ml (20 mM tris-HCl (pH 8,0) na marisi 200 mM NaCl pakon 0,03% (w/w)) ibagas penyangga IMAC ( GE Healthcare). v) β-DDM]. Kolom ai icuci marhitei lima CV penyangga IMAC, dob ai marhitei lima CV penyangga IMAC na marisi 10 mM histidin. Kompleks inti i elusi humbani kolom marhitei lima penyangga IMAC na marisi 100 mM histidin. Fraksi na marisi kompleks RC-LH114-W ikonsentrasihon das hubani ~10 ml ibagas tangki na i aduk na ilengkapi pakon filter Amicon 100.000 MWCO (Merck, UK), iencerkan 20 hali pakon penyangga pengikat, dob ai itambahkon hubani 25 ml Bani kolom DEAE Sepharose, ompat penyangga CV ipakei hubani penyangga b sebelumni. Burihi ma kolom ai marhitei ompat penyangga pengikat CV, dob ai eluasi ma kompleks ai bani ualuh CV bani gradien linier 0 ronsi 100 mM NaCl (ibagas penyangga pengikat), pakon ompat CV na tading na marisi penyangga pengikat 100 mM Kompleks sisa na ielusi bani natrium klorida na ipadomu pakon rasio A8000A pakon 2004 na lobih gijang. Rasio A880/A805 lobih humbani 4,6 fraksi ikonsentrasihon gabe ~2 ml bani filter sentrifugal Amicon 100.000 MWCO, anjaha iisi 1,5 CV IMAC i lobei ni penyangga na seimbang Superdex 200 16/600 kolom pengecualian ukuran, dob ai ieluasi bani penyangga na sarupa lobih humbani 15.000 CV. Patumpu ma spektrum penyerapan fraksi-pecahan ukuran-pengecualian pakon konsentrasihon spektrum penyerapan pakon rasio A880/A280 lobih humbani 2,1 pakon rasio A880/A805 lobih humbani 4,6 ronsi 100 A880, na mintor ipakei laho pasirsirhon kisi TEM beku atap isimpan bani suhu -80°C ronsi porlu.
Sada freezer immersi Leica EM GP ipakei laho pasirsirhon kisi-kisi TEM suhu rendah. Kompleks ai iencerkan bani penyangga IMAC gabe A880 50, dob ai 5μl i muat hubani jala tembaga na baru iluarhon marsinalsal QUANTIFOIL 1.2/1.3 karbon-coated copper (Agar Scientific, UK). Inkubasihon ma kisi-kisi ai bani suhu 20°C pakon 60% kelembaban relatif sadokah 30 s, dob ai hapus ma ai kering sadokah 3 s, dob ai padam ma ai ibagas etan cair bani suhu -176°C.
Data kompleks RC-LH114-W isuratkon bani eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) mamakei mikroskop Titan Krios, na marhorja bani tegangan percepatan 300kV, pakon pembesaran nominal 130.000× pakon celah energi 200V. Sada Gatan 968 GIF Quantum pakon detektor puncak K2 ipakei laho manrekam gambar ibagas mode parhitungan laho patumpuhon data. Ukuran piksel na dob ikalibrasi aima 1.048Å, pakon tingkat dosis aima 3.83 e-Å-2s-1. Ipatumpu ma film ai ibagas 11 detik anjaha ibagi ma ai gabe 40 bagian. Pakei ma ianan na ilapisi karbon laho memfokuskan use mikroskop, dob ai patumpu ma tolu film per lubang. Haganup, 3130 film na ipatumpu, pakon nilai defokus antara -1 pakon -3μm.
Data untuk kompleks RC-LH116 ipatumpu mamakei mikroskop na sarupa i Laboratorium Biostruktur Asterbury (Universitas Leeds, Inggris). Data ipatumpu ibagas mode parhitungan marhiteihon perbesaran 130 k, pakon ukuran piksel ikalibrasi gabe 1,065 Å marhiteihon dosis 4,6 e-Å-2s-1. Film ai i rekam ibagas 12 detik janah ibagi gabe 48 bagian. Haganup, 3359 film na ipatumpu, pakon nilai defokus antara -1 pakon -3μm.
Haganup pemrosesan data ibahen bani pipeline Relion 3.0 (42). Pakei ma Motioncorr 2 (43) laho papintorhon gerakan balok marhiteihon pembobotan dosis, dob ai pakei ma CTFFIND 4.1 (44) laho manontuhon parameter CTF (fungsi transfer kontras). Fotomikrograf khas dob tahap pemrosesan awal on ipatuduh bani Gambar 2. S16. Templat pemilihan otomatis ihasilhon marhitei na mamilih secara manual hira-hira 250 piksel humbani 1000 partikel ibagas bingkai 250 piksel pakon lang dong klasifikasi dua dimensi (2D) referensi, marhitei ai itulak ma klasifikasi na memenuhi kontaminasi sampel atap lang dong sifat na boi ididah. Dob ai, ibahen ma pemilihan otomatis bani ganup mikrofoto, anjaha RC-LH114-W aima 849.359 partikel, pakon kompleks RC-LH116 aima 476.547 partikel. Haganup partikel na ipilih domma mandalani dua putaran klasifikasi 2D non-referensi, anjaha dobkonsi ganup pardalanan, partikel na pajumpah pakon luas karbon, kontaminasi sampel, lang dong fitur na jelas atap partikel na tumpang tindih kuat itulak, mangkorhon 772.033 (90,9%) pakon 359.678 (75,5%) partikel ipakei bani klasifikasi 3D 3D. RC-LH114-W pakon RC-LH116 masing-masing. Model referensi 3D awal ihasilhon mamakei metode penurunan gradien stokastik. Manggunahon model awal sebagai referensi, partikel na ipilih ibagi gabe ompat kategori ibagas 3D. Manggunahon model bani kategori on sebagai referensi, bahen ma pemurnian 3D bani partikel-partikel bani kategori na paling banggal, dob ai pakei ma filter low-pass 15Å awal laho manutupi daerah pelarut, tambahkon 6 piksel tepi na lembut, pakon post-proses piksel ai laho patorangkon fungsi transfer Modulasi puncak Gatan K2 ni detektor atas. Bani dataset RC-LH114-W, model awal on iubah marhitei na padaohkon kepadatan na gogoh i pinggir ni masker (na lang mardomu humbani kepadatan kompleks inti i UCSF Chimera). Model na ihasilhon (resolusi RC-LH114-W pakon RC-LH116 aima 3,91 pakon 4,16 Å, masing-masing) ipakei sebagai referensi bani putaran paduahon klasifikasi 3D. Partikel-partikel na ipakei ikelompokkon hubani kelas 3D awal janah lang marisi korelasi na kuat pakon lingkungan. Tumpang tindih atap lang dong fitur struktural na jelas. Dobkonsi putaran paduahon klasifikasi 3D, ipilih ma kategori na marresolusi tertinggi [Bani RC-LH114-W, sada kategori aima 377.703 partikel (44,5%), bani RC-LH116, dong dua kategori, marjumlah 260.752 partikel (54,7 W%), pitah na sarupa do sidea i pudi. rotasi awal pakon perbedaan na etek]. Partikel-partikel na ipilih ibuat use ibagas kotak 400-piksel janah iperbaiki marhitei pemurnian 3D. Masker pelarut ihasilhon mamakei filter low-pass 15Å awal, ekspansi peta 3 piksel pakon masker lembut 3 piksel. Manggunahon penyempurnaan CTF per-partikel, koreksi gerak per-partikel pakon putaran paduahon penyempurnaan CTF per-partikel, penyempurnaan 3D, penyamaran pelarut pakon pasca-pengolahan ibahen dob salosei ganup langkah laho lambin pajengeskon tekstur na ihasilhon. Manggunahon nilai potong FSC (Koefisien Korelasi Cangkang Fourier) 0,143, resolusi model akhir RC-LH114-W pakon RC-LH116 aima 2,65 pakon 2,80Å, masing-masing. Kurva FSC model akhir ipatuduh bani Gambar 2. S17.
Haganup urutan protein i-download humbani UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) ipakei laho mambahen model homologi RC, na marisi urutan protein RC-L, RC-M pakon RC-H pakon struktur kristal Rba. sphaeroides RC ipakei sebagai template (PDB ID: 5LSE) (46). Manggunahon alat “fit map” i UCSF Chimera laho paskon model na ihasilhon hubani peta (47), padearhon struktur protein, pakon kofaktor [4×BChl a (goran residu perpustakaan monomer = BCL), 2×BPh a (BPH), sada atap dua jenis UQ10 (U10), sada non-heme iron (Fe) pakon sada heksadikokarilin,34 (QAK)] pakei Coot (48) laho manambahkon. Halani QAK lang dong bani perpustakaan monomer, iparameterhon mamakei alat eLBOW i PHENIX (49).
Dob ai, ipajongjong ma subunit LH1. Bani mungkahni, alat konstruksi otomatis i PHENIX (49) ipakei laho mambangun secara otomatis bagian humbani urutan LH1 mamakei peta pakon urutan protein LH1-α pakon LH1-β sebagai masukan. Pilih ma subunit LH1 na paling lengkap, ekstrak ma ai anjaha muat ma ai hu Coot, tambahkon ma urutan na hurang ibagas ai secara manual, anjaha perbaiki ma ganup struktur ai secara manual paima itambahkon dua BCls a (BCL) pakon sada spiriloxanthin (CRT) [domu hubani Rps na bersangkutan Kepadatan kompleks LH1 pakon kandungan karotenoid na dob ibotoh. Spesies (17)]. Salin ma subunit LH1 na lengkap, anjaha pakei ma UCSF Chimera “Docking Map Tool” laho mandok i daerah non-model na berdekatan pakon kepadatan LH1, dob ai perbaiki ma ai i Coot; ulangi proses ai ronsi haganup subunit LH1 domma imodelhon. Bani struktur RC-LH114-W, marhitei na mambuat kepadatan na lang ialokasihon i Coot, protein ai ibagi humbani komponen non-protein na tading bani peta Chimera USCF pakon alat Autobuild ipakei laho pajongjongkon model awal, pakon subunit na tading (protein-W) Pemodelan. I PHENIX (49). Tambahkon ma urutan na hurang hubani model na ihasilhon i Coot (48), dob ai perbaiki ma ganup subunit ai secara manual. Kepadatan na tading na lang ialokasihon sosok pakon kombinasi lipid (ID perpustakaan monomer PDB CDL = CDL, POPC = 6PL pakon POPG = PGT), deterjen β-DDM (LMT) pakon molekul UQ10 (U10). Manggunahon optimasi PHENIX (49) pakon optimasi manual i Coot (48) laho menyempurnahon model awal na lengkap ronsi statistik model pakon kualitas visual na pas lang boi be iperbaiki. Ujungni, pakei ma LocScale (50) laho patajamkon peta lokal, dob ai bahen ma piga-piga siklus na legan laho mamodelhon kepadatan na lang ialokasihon pakon optimasi otomatis pakon manual.
Peptida, kofaktor pakon lipid pakon quinon na legan na mardomu bani kepadatan ni bei ipatuduh bani Gambar 1 pakon 2. S18 das hubani S23. Informasi statistik model akhir ipatuduh bani Tabel S1.
Anggo lang ipatugah na legan, spektrum penyerapan UV/Vis/NIR ipatumpu bani spektrofotometer Cary60 (Agilent, USA) bani interval 1 nm humbani 250 nm das hubani 1000 nm pakon panorang integrasi 0,1 s.
Encerhon ma sampel ai bani kuvet kuarsa na marjalur 2 mm hu A880 humbani 1, anjaha patumpu ma spektrum penyerapan antara 400 pakon 1000 nm. Spektrum dikroik na marlingkar ipatumpu bani spektropolarimeter Jasco 810 (Jasco, Jepang) bani interval 1 nm antara 400 nm pakon 950 nm bani kecepatan pindai 20 nm min-1.
Koefisien kepunahan molar itontuhon marhitei na manencerhon kompleks inti gabe A880 hira-hira 50. Encerhon ma volume 10 μl bani 990 μl penyangga pengikat atap metanol, anjaha patumpu ma spektrum penyerapan mintor laho meminimalhon degradasi BChl. Kandungan BChl bani ganup sampel metanol iparetongkon marhitei koefisien kepunahan bani 771 nm 54,8 mM-1 cm-1, anjaha koefisien kepunahan itontuhon (51). Bagihon ma konsentrasi BChl na dob iukur marhitei 32 (RC-LH114-W) atap 36 (RC-LH116) laho manontuhon konsentrasi kompleks inti, na dob ai ipakei laho manontuhon spektrum penyerapan sampel na sarupa na ipatumpu bani koefisien Kepunahan penyangga. sambil. Tolu hali pangukuran na iulakkon ibahen bani ganup sampel, anjaha absorbansi rata-rata BChl Qy maksimum ipakei laho mangetong. Koefisien kepunahan RC-LH114-W na iukur bani 878 nm aima 3280±140 mM-1 cm-1, sementara koefisien kepunahan RC-LH116 na iukur bani 880 nm aima 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 iukur mangihutkon metode na dong bani (52). Singkatni, HPLC fase terbalik (RP-HPLC) ibahen mamakei sistem HPLC Agilent 1200. Larutkon ma hira-hira 0,02 nmol RC-LH116 atap RC-LH114-W ibagas 50μl 50:50 metanol:kloroform na marisi 0,02% (w/v) ferric chloride, dob ai suntikkon ma Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4 na dob seimbang hinan Larutkon ma bani 1-1-1-ml. 40°C ibagas pelarut HPLC (80:20 metanol:2-propanol) bani kolom ×25 cm. Bahen ma elusi isokratik bani pelarut HPLC laho mamareksa absorbansi bani 275 nm (UQ10), 450 nm (karotenoid) pakon 780 nm (BChl) sadokah 1 jam. Puncak bani kromatogram 275 nm bani 25,5 menit domma terintegrasi, na lang marisi senyawa na legan na boi ideteksi. Area na dob ipadomu ipakei laho mangetong jumlah molar UQ10 na iekstraksi mangihutkon kurva kalibrasi na iparetongkon humbani suntikan standar murni humbani 0 ronsi 5,8 nmol (Gambar S14). Ganup sampel ipareksa ibagas tolu replika, anjaha kesalahan na ilaporhon sadalan hubani SD rata-rata.
Sada larutan na marisi kompleks RC-LH1 pakon penyerapan Qy maksimal 0,1 ipasirsir marhitei 30 μM sitokrom jantung kuda c2 na iurangi (Merck, Inggris) pakon 0 ronsi 50 μMUQ2 (Merck, Inggris). Tolu sampel 1-ml ipasirsir bani ganup konsentrasi UQ2 janah iinkubasi saborngin ibagas na golap bani suhu 4°C laho memastikan adaptasi na lengkap hubani na golap paima pangukuran. Larutan ai imasukhon hubagas spektrofotometer modular OLIS RSM1000 na ilengkapi pakon kisi-kisi 300 nm api/500 garis, 1,24 mm masuk, 0,12 mm tongah pakon 0,6 mm celah kaluar. Sada filter 600 nm long pass ibahen bani labah masuk ni tabung foto sampel pakon tabung foto pengganda referensi laho padaohkon cahaya eksitasi. Absorbansi i pantau bani 550 nm pakon panorang integrasi 0,15 s. Cahaya eksitasi ipancarhon humbani 880 nm M880F2 LED (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., UK) marhiteihon kabel serat optik bani intensitas 90% marhiteihon pengontrol DC2200 (Thorlabs Ltd., UK) pakon ipancarhon hubani sumber cahaya bani sudut 90°. Sinar pangukuran ai berlawanan pakon sormin laho paulakhon panondang na lang iserapkon sampel ai bani mungkahni. Pantau absorbansi 10 s paima penerangan 50 s. Dob ai, absorbansi ai i pantau do use sadokah 60 s ibagas na golap laho menilai sejauh aha do quinolol secara spontan mangurangi sitokrom c23 + (idah Gambar S8 untuk data mentah).
Data ai iproses marhitei na paskon laju awal linier ibagas 0,5 ronsi 10 s (tergantung hubani konsentrasi UQ2) pakon meratahon laju ni ganup tolu sampel bani ganup konsentrasi UQ2. Konsentrasi RC-LH1 na iparetongkon marhitei koefisien kepunahan masing-masing ipakei laho mangubah laju gabe efisiensi katalitik, i plot bani Origin Pro 2019 (OriginLab, USA), pakon ipasang bani model Michaelis-Menten laho manontuhon nilai Km pakon Kcat na taridah.
Bani pangukuran penyerapan sementara, sampel RC-LH1 iencerkan gabe ~2μM ibagas penyangga IMAC na marisi 50 mM natrium askorbat (Merck, USA) pakon 0,4 mM Terbutin (Merck, USA). Asam askorbat ipakei sebagai donor elektron pengorbanan, pakon tert-butaclofen ipakei sebagai penghambat QB laho memastikan donor RC utama totap do iurangi (ai ma, lang fotooksidasi) sadokah proses pangukuran. Hira-hira 3 ml sampel itambahkon hubani sel na marputar khusus (hira-hira 0,1 m diameterni, 350 RPM) pakon ganjang jalur optik 2 mm laho memastikan sampel na adong bani jalur laser memiliki panorang na cukup untuk adaptasi na golap antara pulsa eksitasi. Pakei ma pulsa laser ~100-fs laho mampargogohi sistem laser Ti: Sapphire (Spectra Physics, USA) laho mambahen eksitasi sampel bani 880 nm bani tingkat pengulangan 1 kHz (20 nJ bani NIR atap 100 nJ bani Vis). Paima patumpuhon data, bahen ma sampel ai hubani cahaya eksitasi hira-hira 30 menit. Paparan mambahen QA lang marhorja (mungkin mangurangi QA sahali atap dua hali). Tapi porlu ibotoh hita anggo proses on boi do ibalikkon halani dob dokah adaptasi na golap, RC lambin otik do mulak hubani kegiatan QA. Sada spektrometer Helios (Ultrafast Systems, USA) ipakei laho mangukur spektrum sementara pakon panorang penundaan -10 ronsi 7000 ps. Pakei ma perangkat lunak Surface Xplorer (Ultrafast Systems, USA) laho mambuka kelompok data, dob ai padomu pakon standarhon. Pakei ma paket perangkat lunak CarpetView (Light Conversion Ltd., Lithuania) laho mamakei kumpulan data na ipadomu laho mandapotkon spektrum diferensial na marpardomuan hubani peluruhan, atap pakei ma fungsi na mambahen buei eksponen pakon respon instrumen ase sosok pakon evolusi spektral panjang gelombang tunggal i Origin (OriginLab, USA).
Songon na dob isobut i atas (53), sada film fotosintesis na marisi kompleks LH1 na lang dong RC pakon antena LH2 perifer domma ipasirsir. Membran ai iencerkan ibagas 20 mM tris (pH 8,0) dob ai imasukhon hubagas kuvet kuarsa na marjalur optik 2 mm. Sada pulsa laser 30nJ ipakei laho menggembirahon sampel bani 540 nm pakon panorang penundaan -10 ronsi 7000 ps. Proses ma data set songon na dob ipatugah bani Rps. hasoman contoh.
Membran ai ipelet marhitei sentrifugasi bani 150.000 RCF sadokah 2 jam bani 4°C, dob ai absorbansi ni bani 880 nm isuspensihon use bani 20 mM tris-HCl (pH 8,0) pakon 200 mM NaCl. Larutkon ma membran ai marhitei na mangaduk palan-palan 2% (w/v) β-DDM sadokah 1 jam ibagas na golap bani suhu 4°C. Sampel ai iencerkan bani 100 mM triethylammonium carbonate (pH 8.0) (TEAB; Merck, UK) das hubani konsentrasi protein 2.5 mg ml-1 (analisis Bio-Rad). Pengolahan selanjutni ibahen humbani metode na dob iterbitkon sebelumni (54), imulaini marhiteihon pengenceran 50 μg protein gabe total 50 μl TEAB na marisi 1% (w/v) natrium laurat (Merck, UK). Dob sonikasi sadokah 60 s, iurangi ma ai marhitei 5 mM tris(2-karboksietil)fosfin (Merck, Inggris) bani 37°C sadokah 30 menit. Bani S-alkilasi, inkubasi ma sampel ai pakon 10 mM metil S-metilthiometansulfonat (Merck, Inggris) dob ai tambahkon ma ai humbani larutan stok isopropanol 200 mM sadokah 10 menit bani suhu kamar. Pencernaan proteolitik ibahen marhitei na manambahkon 2 μg campuran trypsin/endoproteinase Lys-C (Promega UK) pakon i inkubasi bani 37°C sadokah 3 jam. Surfaktan laurat i ekstrak marhitei na manambahkon 50 μl etil asetat pakon 10 μl 10% (v/v) asam trifluoroasetat kelas LC (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) pakon vortexing sadokah 60 s. Pemisahan fase ipromosihon marhiteihon sentrifugasi bani 15.700 RCF sadokah 5 menit. Domu hubani protokol ni pabrik, kolom putar C18 (Thermo Fisher Scientific, UK) ipakei laho mangaspirasi pakon padaohkon garam fase toruh na marisi peptida. Dob ikerangkon marhitei sentrifugasi vakum, sampel ai ilarutkon bani 0,5% TFA pakon 3% asetonitril, anjaha 500 ng ipareksa marhitei kromatografi RP nanoflow na itambahkon pakon spektrometri massa mamakei parameter sistem na dob i rincihon sebelumni.
Pakei ma MaxQuant v.1.5.3.30 (56) laho mangindahi pakon mangukur protein laho mangindahi Rps. basis data proteom palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Data proteomik spektrometri massa domma isimpan i ProteomeXchange Alliance marhiteihon repositori mitra PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) i toruh ni pengidentifikasi dataset PXD020402.
Bani analisis marhitei RPLC na itambahkon pakon spektrometri massa ionisasi elektrospray, kompleks RC-LH1 ipasirsir humbani Rps tipe liar. Manggunahon metode na dob iterbitkon sebelumni (16), konsentrasi protein na ihasilhon bani sel palustris aima 2 mg ml-1 ibagas 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl pakon 0,03% (w/v) β- (analisis Bio-Rad) ) DDM. Domu hubani protokol ni pabrik, pakei ma kit pemurnian 2D (GE Healthcare, USA) laho mambuat 10 μg protein marhitei metode pengendapan, dob ai larutkon ma pengendapan ai ibagas 20 μl 60% (v/v) asam formik (FA), 20% (v/v) Acetonitrile pakon 20% (v/v) bah. Lima mikroliter ipareksa marhitei RPLC (Dionex RSLC) na itambahkon pakon spektrometri massa (Maxis UHR-TOF, Bruker). Manggunahon MabPac 1.2×100 mm kolom (Thermo Fisher Scientific, UK) laho mamisahkon bani 60°C pakon 100μlmin -1, pakon gradien 85% (v / v) pelarut A [0.1% (v / v) FA pakon 0.02% (V/v) TFA larutan berair] hubani pelarut 5% Bv/v) [0.1%(v/v) FA pakon 0.02%(v/v) ibagas 90%(v/v) asetonitril TFA] Manggunahon sumber ionisasi elektrospray standar pakon parameter bawaan lobih humbani 60 menit, spektrometer massa dapotan 100 ronsi 2750 m/z (rasio muatan massa). Marhitei pangurupion ni portal sumber daya bioinformatika ExPASy FindPept tool (https://web.expasy.org/findpept/), petahon ma spektrum massa hubani subunit-subunit ni kompleks ai.
Sel-sel ai ipatubuh sadokah 72 jam i toruh ni 100 ml NF-rendah (10μMm-2 s-1), menengah (30μMm-2 s-1) atap tinggi (300μMm-2 s-1) cahaya. M22 medium (M22 medium na ija amonium sulfat ipadaoh janah natrium suksinat igantihkon natrium asetat) ibagas botol 100 ml na martopi sekrup (23). Bani lima siklus 30-s, manik-manik kaca 0,1 mikron manik-manik bani rasio volume 1:1 laho manlisis sel-sel ai janah ipadingat i atas es sadokah 5 menit. Bahan na lang larut, sel na lang putus pakon manik-manik kaca ipadaoh marhitei sentrifugasi bani 16.000 RCF sadokah 10 menit ibagas mikrosentrifugal meja. Membran ai ipisahon bani rotor Ti 70.1 pakon 100.000 RCF ibagas 20 mM tris-HCl (pH 8.0) pakon gradien sukrosa 40/15% (w/w) sadokah 10 jam.
Songon na dob ipatugah bani horja nami sebelumni, imunodeteksi tag His bani PufW (16). Singkatni, kompleks inti na dob imurnihkon (11,8 nM) atap membran na marisi konsentrasi RC na sarupa (na itontuhon marhitei oksidasi na mangurangi spektrum perbedaan na iurangi pakon na mancocokkon beban bani gel na iwarnai) ibagas penyangga pemuatan 2x SDS (Merck, UK) na iencerkan dua hali. Protein ai ipisahon bani replika 12% bis-tris NuPage gel (Thermo Fisher Scientific, UK). Sada gel iwarnai pakon Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) laho mamuat pakon mangidah subunit RC-L. Protein na adong bani gel paduahon ipindahi hubani membran polivinilidena fluorida (PVDF) na iaktifkon metanol (Thermo Fisher Scientific, UK) laho mambahen immunoassay. Membran PVDF iblokir ibagas 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,2% (v / v) Tween-20 pakon 5% (w / v) susu bubuk skim, dob ai iinkubasi pakon antibodi primer anti-His (ibagas penyangga antibodi encer [50 mM H-HCl) 7.6), 150 mM NaCl pakon 0.05% (v/v) Tween-20] ibagas 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA) sadokah 4 jam. Dobkonsi iburihi 3 hali sadokah 5 menit ibagas penyangga antibodi, membran ai ipadomu pakon antibodi sekunder anti-tikus horseradish peroksidase (Sigma-Aldrich, UK) (iencerkan 1:10.000 ibagas penyangga antibodi) Inkubasi ase boi deteksi (5 menit dob ​​3 hali icuci ibagas penyangga antibodi) mamakei WAR EST 2000. substrat chemiluminescence (Cyanagen, Italia) pakon Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Inggris).
Marhitei na manggambarhon distribusi intensitas ni ganup gel na iwarnai atap jalur imunoassay, mengintegrasihon daerah i toruh ni puncak pakon mangetong rasio intensitas RC-L (gel na iwarnai) pakon Protein-W (immunoassay), bani ImageJ (57) Proses gambar ai. Rasio-rasio on iubah gabe rasio molar marhitei na mangasumsihon rasio RC-L hubani protein-W bani sampel RC-LH114-W murni aima 1:1 pakon menormalhon ganup kumpulan data na sosok.
Anggo dong bahan tambahan bani artikel on, boi do ididah nasiam http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
On aima artikel akses terbuka na ibagihon mangihutkon syarat Lisensi Atribusi Creative Commons. Artikel on mangijinhon penggunaan, distribusi, pakon reproduksi na lang terbatas bani media aha pe ibagas syarat anggo karya aslini ikutiphon dear.
Catatan: Hanami pitah mangindo ase nassiam mambere alamat email nassiam ase halak na isaranhon nassiam hu halaman on mambotoh anggo nassiam sihol mangidah email ai janah lang spam. Lang ra hanami manangkap alamat email.
Sungkun-sungkun on ipakei laho manguji atap na ham do pengunjung pakon mancegah pengiriman spam otomatis.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe , Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirma, Ccoil Hunter, Neilcoil.
Struktur resolusi tinggi kompleks perangkap cahaya 1 i pusat reaksi mambere wawasan na baru pasal dinamika quinone.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe , Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirma, Ccoil Hunter, Neilcoil.
Struktur resolusi tinggi kompleks perangkap cahaya 1 i pusat reaksi mambere wawasan na baru pasal dinamika quinone.
©2021 Asosiasi Amerika untuk Kemajuan Sains. haganup hak ipartahankon. AAAS aima mitra ni HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef pakon COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.