Sonari *Alamat sonari: Cologne 50931, Jerman, Penelitian Klaster Keunggulan Cologne on Respon Stres Seluler bani Penyakit na marpardomuan hubani Penuaan (CECAD).
Neurodegenerasi ni naborit mitokondria ianggap lang boi ibalikkon halani plastisitas metabolisme ni neuron terbatas, tapi efek ni disfungsi mitokondria bani otonomi sel metabolisme neuron i angkula lang torang iarusi. Ijon, hanami patandahon proteom khusus sel neuron Purkinje na mardefisiensi OXPHOS na progresif na ibahen dinamika fusi mitokondria na terganggu. Ijumpahi hanami bahwa disfungsi mitokondria mambahen perubahan na bagas bani bidang proteomik, na ujungni mambahen aktivasi berurutan program metabolisme na tepat paima matei sel. Lang isangka, hanami manontuhon induksi na jelas humbani piruvat karboksilase (PCx) pakon enzim anti-penuaan na legan na melengkapi perantara siklus TCA. Penghambatan PCx mambahen parah stres oksidatif pakon neurodegenerasi, na pataridahkon bahwa aterosklerosis memiliki efek perlindungan bani neuron na hurang OXPHOS. Pemulihan fusi mitokondria bani neuron na dob degenerasi terminal mambahen mubah sifat-sifat metabolisme on, sehingga mencegah kematian sel. Hasil nami mangidentifikasi jalur na lape ongga ibotoh na mambere ketahanan hubani disfungsi mitokondria pakon pataridahkon bahwa neurodegenerasi boi ibalikkon age bani tahap akhir ni naborit ai.
Peran sentral mitokondria bani na manramotkon metabolisme energi saraf itekanhon marhiteihon gejala neurologis na ekstensif na marpardomuan hubani naborit mitokondria ni jolma. Bahatan humbani naborit on ibahen mutasi gen na mangatur ekspresi gen mitokondria (1, 2) atap hasedaon gen na marpardomuan hubani dinamika mitokondria, na secara lang langsung mambahen stabilitas DNA mitokondria (mtDNA) (3, 4). Horja bani model binatang domma patuduhkon bahwa sebagai respon hubani disfungsi mitokondria bani jaringan sekitar, jalur metabolisme konservatif (5-7) boi iaktifkon, na mambere informasi na ponting untuk pemahaman na bagas pasal patogenesis ni naborit na kompleks on. Sebalikni, pangarusionta pasal parubahan metabolisme humbani jenis sel tertentu na ibahen kegagalan umum produksi adenosin trifosfat (ATP) mitokondria otak aima na mendasar (8), na menekanhon porluni mangindahi target terapeutik na boi ipakei laho mancegah atap pe mancegah naborit. Manlanglangi neurodegenerasi (9). Hurangni informasi aima fakta bahwa sel saraf secara luas ianggap memiliki fleksibilitas metabolisme na sangat terbatas ibandingkon hubani jenis sel jaringan sekitarni (10). Halani sel-sel on berperan sentral bani na mengkoordinasihon pasokan metabolit hubani neuron laho mendorong transmisi sinaptik pakon merespon kondisi luka pakon naborit, kemampuan laho menyesuaihon metabolisme sel hubani kondisi jaringan otak na menantang hampir terbatas hubani sel glial (11-14). Leganni ai, heterogenitas seluler na melekat bani jaringan otak sebagian besar menghambat studi perubahan metabolisme na terjadi bani subkelompok saraf tertentu. Hasilni, otik do na ibotoh pasal konsekuensi seluler pakon metabolisme na tepat humbani disfungsi mitokondria bani neuron.
Ase boi iarusi hita konsekuensi metabolisme ni disfungsi mitokondria, isolasi hanami ma neuron Purkinje (PN) bani bagei tahap neurodegenerasi na ibahen hasedaon ni fusi membran luar mitokondria (Mfn2). Hassi pe mutasi Mfn2 bani jolma marpardomuan pakon bentuk neuropati sensorik motorik turun-temurun na isobut Charcot-Marie-Tooth tipe 2A (15), hasedaon kondisional Mfn2 bani tikus aima sada metode disfungsi induksi oksidasi Fosforilasi (OXPHOS) na dob iakui dear. Marmasam subtipe saraf (16-19) pakon fenotipe neurodegeneratif na ihasilhon ihasomani gejala neurologis na progresif, misalni gangguan gerak (18, 19) atap ataksia serebelum (16). Marhitei na mamakei kombinasi proteomik kuantitatif bebas label (LFQ), metabolomik, pencitraan, pakon metode virologis, ipatuduh hanami bahwa neurodegenerasi progresif sangat menginduksi piruvat karboksilase (PCx) pakon faktor-faktor na legan na terlibat bani arteriosklerosis PN in vivo Ekspresi enzim. Laho mamastihon relevansi ni hasil on, hanami secara khusus mangatur ekspresi PCx bani PN na hurang Mfn2, anjaha jumpah hanami do anggo operasi on mambahen parah stres oksidatif pakon mempercepat neurodegenerasi, sehingga mambuktihon bahwa azoospermia mambere kematian sel kemampuan beradaptasi metabolisme. Ekspresi MFN2 na parah boi do sepenuhni paluahkon degenerasi terminal PN pakon defisiensi OXPHOS na parah, konsumsi DNA mitokondria na buei, pakon jaringan mitokondria na rusak, na lambin menekanhon bahasa bentuk neurodegenerasi on boi do homa malum bani tahap lanjut ni naborit paima matei sel.
Ase boi mangidah mitokondria bani Mfn2 knockout PNs, ipakei hanami ma strain tikus na mambahen mitokondria na bergantung hubani Cre boi manargetkan ekspresi protein fluoresen kuning (YFP) (mtYFP) (20) pakon mamareksa morfologi mitokondria in vivo. Ijumpahi hanami do anggo hasedaon ni gen Mfn2 bani PNs mambahen pembagian jaringan mitokondria secara bertahap (Gambar S1A), anjaha parubahan na parlobei jumpah bani umur 3 minggu. Sebalikni, degenerasi substansial lapisan sel PN, songon na ibuktikan marhitei na magou imunostaining Calbindin, lang ipungkah das hubani umur 12 minggu (Gambar 1, A pakon B). Ketidakcocokan waktu antara perubahan morfologi mitokondria na parlobei pakon onset kematian saraf na taridah mendorong hanami laho mamareksa perubahan metabolisme na ipicu disfungsi mitokondria paima kematian sel. Ibahen hanami do strategi berbasis fluoresensi-activated cell sorting (FACS) laho mangisolasi PN na mengekspresihon YFP (YFP+) (Gambar 1C), pakon bani tikus kontrol (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), na isobut CTRL (Gambar S1BRL). Optimalisasi strategi gating berdasarkon intensitas relatif sinyal YFP mambahen hita boi paborsihkon badan YFP+ (YFPhigh) PN humbani non-PN (YFPneg) (Gambar S1B) atap fragmen akson/dendritik neon na ianggap (YFPlow; Gambar S1D, sambilou), na isahkon marhitei mikroskop konfokal (Gambar S1D, kanan). Ase boi iverifikasi identitas ni populasi na iklasipikasihon, ibahen hanami ma proteomik LFQ dob ai analisis komponen utama, anjaha jumpah hanami ma dong pemisahan na jelas antara sel YFPhigh pakon YFPneg (Gambar S1C). Sel YFPhigh pataridahkon pengayaan bersih humbani penanda PNs na dob ibotoh (ai ma Calb1, Pcp2, Grid2 pakon Itpr3) (21, 22), tapi lang dong pengayaan protein na somal iekspresihon bani neuron atap jenis sel na legan (Gambar 1D) ). Sada perbandingan antara sampel bani sel YFPhigh na iklasipikasihon na ipatumpu bani percobaan independen pataridahkon koefisien korelasi> 0,9, na pataridahkon reproduksi na dear antara replika biologis (Gambar S1E). Singkatni, data on memvalidasi rencana nami untuk isolasi akut pakon spesifik PN na layak. Halani sistem penggerak L7-cre na ipakei manginduksi rekombinasi mosaik bani minggu parlobei dob partubuh (23), ipungkah hanami ma mamunuh tikus humbani CTRL pakon kondisional (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Patumpuhon neuron. Dob salosei rekombinasi, igoran ma ai Mfn2cKO bani umur 4 minggu. Sebagai titik ujung, ipilih hanami 8 minggu umur sanggah lapisan PN utuh pori pe fragmentasi mitokondria na jelas (Gambar 1B pakon Gambar S1A). Haganup, iukur hanami do 3013 protein, na hira-hira 22% berdasarkon anotasi MitoCarta 2.0 berdasarhon proteom mitokondria sebagai mitokondria (Gambar 1E) (Gambar 1E) (24). Analisis ekspresi gen diferensial na ibahen bani minggu 8 pataridahkon pitah 10,5% humbani ganup protein na marubah na signifikan (Gambar 1F pakon Gambar S1F), hunjai 195 protein na i-down-regulate pakon 120 protein na i-up-regulate (Gambar 1F). Porlu do ibotoh hita bahasa “analisis jalur inovatif” humbani kumpulan data on pataridahkon bahwa gen na iekspresihon secara berbeda terutama masuk hubani kumpulan jalur metabolisme tertentu na terbatas (Gambar 1G). Na menarik, pori pe penurunan jalur na berkaitan pakon OXPHOS pakon pensinyalan kalsium memastikan induksi disfungsi mitokondria bani PN na hurang fusi, kategori na legan na terutama melibatkon metabolisme asam amino secara signifikan domma iatur hu atas, na sadalan hubani metabolisme na terjadi bani PN mitokondria na konsisten. gangguan.
(A) Foto konfokal representatif bagian serebelum tikus CTRL pakon Mfn2cKO na pataridahkon hilangni PN na lambin parah (calbindin, abu-abu); inti iwarnai pakon DAPI. (B) Kuantifikasi (A) (analisis varians satu arah, ***P<0,001; n = 4 ronsi 6 lingkaran humbani tolu tikus). (C) Alur kerja eksperimental. (D) Distribusi peta panas penanda khusus Purkinje (atap) pakon jenis sel na legan (tongah). (E) Diagram Venn na pataridahkon bilangan ni protein mitokondria na itandahon bani PN na iklasipikasihon. (F) Plot gunung berapi protein na iekspresihon secara berbeda bani neuron Mfn2cKO bani 8 minggu (nilai batas signifikansi 1,3). (G) Analisis jalur kreativitas pataridahkon lima jalur up-regulasi (merah) pakon down-regulasi (biru) na paling ponting bani Mfn2cKO PN na iklasipikasihon sebagai 8 minggu. Ipatuduh do tingkat ekspresi rata-rata humbani ganup protein na tardeteksi. Peta panas skala abu-abu: nilai P na dob iubah. ns, lang ponting.
Data proteomik pataridahkon bahwa ekspresi protein kompleks I, III, pakon IV lambin moru. Kompleks I, III, pakon IV haganupan marisi subunit na ikodehon mtDNA na porlu, sementara kompleks II, na pitah ikodehon nuklir, lang terpengaruh (Gambar 2A pakon Gambar S2A). . Domu hubani hasil proteomik, imunohistokimia bagian jaringan serebelum pataridahkon bahwa MTCO1 (mitokondria sitokrom C oksidase subunit 1) tingkat subunit kompleks IV i PN lambin moru (Gambar 2B). Subunit Mtatp8 na ikodehon mtDNA secara signifikan markurang (Gambar S2A), sementara tingkat keadaan mantap subunit ATP sintase na ikodehon nuklir totap lang marubah, na sadalan hubani kompleks subrakitan ATP sintase F1 na stabil na dob ibotoh sanggah ekspresi mtDNA stabil. Pembentukan ai totap do. Potong (7). Evaluasi tingkat mtDNA bani Mfn2cKO PN na ipilih marhitei reaksi berantai polimerase waktu nyata (qPCR) memastikan penurunan bertahap bani jumlah salinan mtDNA. Ibandingkon pakon kelompok kontrol, bani umur 8 minggu, pitah hira-hira 20% do hansa tingkat mtDNA na totap (Gambar 2C). Domu hubani hasil on, pewarnaan mikroskop konfokal Mfn2cKO PNs ipakei laho mangidah DNA, na pataridahkon konsumsi nukleotida mitokondria na bergantung hubani panorang (Gambar 2D). Ijumpahi hanami pitah piga-piga kandidat na terlibat bani degradasi protein mitokondria pakon respon stres na iatur hu atas, termasuk Lonp1, Afg3l2 pakon Clpx, pakon faktor perakitan kompleks OXPHOS. Lang dong parubahan na signifikan bani tingkat protein na terlibat bani apoptosis na tardeteksi (Gambar S2B). Sonai homa, jumpah hanami do anggo saluran mitokondria pakon retikulum endoplasma na dihut bani transportasi kalsium pitah dong parubahan na etek (Gambar S2C). Leganni ai, evaluasi protein na marpardomuan hubani autofagi lang dong jumpah parubahan na signifikan, na sadalan hubani induksi na taridah humbani autofagosom na ididah in vivo marhitei imunohistokimia pakon mikroskop elektron (Gambar S3). Tapi, disfungsi OXPHOS na progresif bani PNs ihasomani perubahan mitokondria ultrastruktural na jelas. Gugusan mitokondria boi ididah bani badan sel pakon pohon dendritik Mfn2cKO PNs na marumur 5 pakon 8 minggu, pakon struktur membran batin domma mengalami perubahan na bagas (Gambar S4, A pakon B). Domu hubani parubahan ultrastruktur on pakon penurunan na signifikan bani mtDNA, analisis irisan otak akut pakon tetrametilrodamin metil ester (TMRM) pataridahkon bahwa potensi membran mitokondria bani Mfn2cKO PNs markurang secara signifikan (Gambar S4C).
(A) Analisis pardalanan ni panorang tingkat ekspresi kompleks OXPHOS. Pitah mamingkiri protein na mar-P<0.05 bani 8 minggu (ANOVA dua arah). Garis titik-titik: Lang dong penyesuaian anggo ibandingkon pakon CTRL. (B) Kiri: Contoh bagian otak na marlabel antibodi anti-MTCO1 (bar skala, 20 μm). Ianan na iiankon badan sel Purkinje itutupi warna kuning. Kanan: Kuantifikasi tingkat MTCO1 (analisis varians satu arah; n = 7 ronsi 20 sel na ipareksa humbani tolu tikus). (C) Analisis qPCR nomor salinan mtDNA bani PN na iurutkon (analisis varians satu arah; n = 3 ronsi 7 tikus). (D) Kiri: Contoh irisan serebelum na marlabel antibodi anti-DNA (bar skala, 20 μm). Ianan na iiankon badan sel Purkinje itutupi warna kuning. Kanan: Kuantifikasi lesi mtDNA (analisis varians satu arah; n = 5 ronsi 9 sel humbani tolu tikus). (E) Sada contoh bagian serebelum akut na pataridahkon sel mitoYFP + Purkinje (panah) bani rekaman penjepit tambalan sel-sel. (F) Ukuran kurva IV. (G) Rekaman representatif injeksi arus depolarisasi bani sel CTRL pakon Mfn2cKO Purkinje. Jejak atas: Denyut nadi na parlobei na mambahen AP. Jejak toruh: Frekuensi AP maksimal. (H) Ukuran masukan spontan postsinaptik (sPSPs). Jejak rekaman representatif pakon rasio zoomni ipatuduh bani (I). Analisis varians sada arah menganalisa n = 5 ronsi 20 sel humbani tolu tikus. Data ipatugah songon rata-rata±SEM; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) Jejak representatif AP spontan na i rekam mamakei mode penjepit tambal berlubang. Jejak atas: Frekuensi AP maksimal. Jejak toruh: zoom ni sada AP. (K) Mangukur frekuensi AP rata-rata pakon maksimum mangihutkon (J). Mann-Whitney tes; n = 5 sel ipareksa humbani ompat tikus. Data ipatugah songon rata-rata±SEM; lang ponting.
Kerusakan OXPHOS na jelas tardeteksi bani Mfn2cKO PN na marumur 8 minggu, na pataridahkon anggo fungsi fisiologis ni neuron sangat lang normal. Halani ai, hanami menganalisa karakteristik listrik pasif ni neuron na hurang OXPHOS bani 4 ronsi 5 minggu pakon 7 ronsi 8 minggu marhitei na mambahen rekaman penjepit tambal seluruh sel bani irisan serebelum akut (Gambar 2E). Lang isangka, potensi membran istirahat rata-rata pakon resistensi masukan neuron Mfn2cKO sarupa pakon kontrol, hassi pe dong perbedaan halus antara sel (Tabel 1). Sonai homa, bani umur 4 ronsi 5 minggu, lang dong jumpah parubahan na signifikan bani hubungan arus-tegangan (kurva IV) (Gambar 2F). Tapi, lang dong neuron Mfn2cKO na marumur 7 ronsi 8 minggu na bertahan humbani rejimen IV (langkah hiperpolarisasi), na pataridahkon dong sensitivitas na jelas hubani potensi hiperpolarisasi bani tahap akhir on. Sebalikni, bani neuron Mfn2cKO, arus depolarisasi na mambahen debit potensial aksi berulang (AP) dear do itoleransihon, na pataridahkon bahwa pola debit ni sidea secara keseluruhan lang berbeda secara signifikan humbani neuron kontrol na marumur 8 minggu (Tabel 1 pakon Gambar 2G). Sonai homa, frekuensi pakon amplitudo arus postsinaptik spontan (sPSCs) sebanding pakon kelompok kontrol, pakon frekuensi peristiwa meningkat humbani 4 minggu gabe 5 minggu gabe 7 minggu gabe 8 minggu pakon peningkatan na sarupa (Gambar 2, H pakon I). Periode pematangan sinaptik bani PN (25). Hasil na sarupa dapot dobkonsi tambalan PNs na marlubang. Konfigurasi on mancegah kemungkinan kompensasi cacat ATP seluler, songon na terjadi bani rekaman penjepit tambal seluruh sel. Secara khusus, potensi membran istirahat pakon frekuensi penembakan spontan neuron Mfn2cKO lang terpengaruh (Gambar 2, J pakon K). Singkatni, hasil on pataridahkon bahwa PN na mardisfungsi OXPHOS na jelas boi mangatasi pola debit frekuensi tinggi dear, na pataridahkon bahwa dong mekanisme kompensasi na mambahen sidea boi mampartahankon respon elektrofisiologis na hampir normal.
Data ipatugah songon rata-rata ± SEM (analisis varians satu arah, tes perbandingan berganda Holm-Sidak; *P<0,05). Nomor satuan ipatuduh marhiteihon kurung.
Ibahen hanami do laho manliti atap dong do kategori bani dataset proteomik (Gambar 1G) na mencakup jalur na boi manlawan defisiensi OXPHOS na parah, marhitei ai patorangkon mase PN na hona boi mampartahankon elektrofisiologi na hampir normal (Gambar 2, E ronsi K). . Analisis proteomik pataridahkon bahwa enzim na terlibat bani katabolisme asam amino berantai bercabang (BCAA) secara signifikan iatur hu atas (Gambar 3A pakon Gambar S5A), pakon produk akhir asetil-CoA (CoA) atap suksinil CoA boi melengkapi trikarboksilat bani siklus Asam arteriosklerosis (TCA). Ijumpahi hanami do anggo kandungan BCAA transaminase 1 (BCAT1) pakon BCAT2 haduasi martambah. Sidea mangkatalisasi langkah parlobei katabolisme BCAA marhitei na mambahen glutamat humbani α-ketoglutarate (26). Haganup subunit na mambahen kompleks keto asam dehidrogenase (BCKD) rantai bercabang iatur hu atas (kompleks ai mangkatalisasi dekarboksilasi selanjutni pakon na lang boi ibalikkon humbani kerangka karbon BCAA na ihasilhon) (Gambar 3A pakon Gambar S5A). Tapi, lang dong parubahan na jelas bani BCAA sandiri na jumpah bani PN na ipilih, na mungkin halani peningkatan pengambilan sel asam amino esensial on atap pe penggunaan sumber na legan (glukosa atap asam laktat) laho melengkapi siklus TCA (Gambar S5B). PN na hurang OXPHOS pataridahkon homa peningkatan dekomposisi glutamin pakon aktivitas transaminasi bani umur 8 minggu, na boi taridah marhiteihon peningkatan enzim mitokondria glutaminase (GLS) pakon glutamin piruvat transaminase 2 (GPT2) (Gambar 3, A pakon C). Porlu do ibotoh hita anggo peningkatan GLS terbatas hubani isoform glutaminase C na isambung (GLS-GAC) (perubahan Mfn2cKO/CTRL hira-hira 4,5 hali lipat, P = 0,05), pakon peningkatan spesifikni bani jaringan kanker Boi mendukung bioenergi mitokondria. (27).
(A) Peta panas pataridahkon lipatan perubahan tingkat protein bani rute na dob itontuhon bani 8 minggu. (B) Contoh irisan serebelum na marlabel antibodi anti-PCx (bar skala, 20 μm). Panah na marwarna kuning ai manuju hubani badan sel Purkinje. (C) Analisis ekspresi protein pardalanan panorang na itandahon sebagai kandidat na ponting bani aterosklerosis (uji t-ganda, *FDR <5%; n = 3-5 tikus). (D) I atas: Gambar skematik na pataridahkon cara na berbeda laho masuk hu karbon na marlabel na adong bani [1-13C]pyruvate tracer (ai ma, marhitei PDH atap rute trans-arteri). I toruh: Bagan biola pataridahkon persentase karbon na marlabel tunggal (M1) na iubah gabe asam aspartat, asam sitrat pakon asam malat dob ​​ibere label irisan serebelum akut marhitei [1-13C]piruvat (uji t berpasangan; ** P <0,01). (E) Analisis sejarah waktu na komprehensif humbani dalan na ipatuduh. Pitah mamingkiri protein na mar-P<0.05 bani 8 minggu. Garis putus-putus: lang dong nilai penyesuaian (analisis varians dua arah; * P <0,05; *** P <0,001). Data ipatugah songon rata-rata±SEM.
Bani analisis nami, katabolisme BCAA domma gabe salah sada jalur peningkatan kunci. Fakta on sangat menunjukkan bahwa volume ventilasi na masuk hu siklus TCA boi do berubah bani PN na hurang OXPHOS. On boi mewakili bentuk utama rewiring metabolisme neuron, na boi berdampak langsung hubani fisiologi neuron pakon kelangsungan hidup sanggah pemeliharaan disfungsi OXPHOS na parah. Domu hubani hipotesis on, jumpah hanami bahwa enzim anti-aterosklerotik utama PCx iatur hu atas (Mfn2cKO/CTRL berubah hira-hira 1,5 hali; Gambar 3A), na mengkatalisis konversi piruvat gabe oksaloasetat (28), na ihaporsayai ibagas jaringan otak terbatas ekspresi astrosis (29, 30). Domu hubani hasil proteomik, mikroskop konfokal pataridahkon bahwa ekspresi PCx secara khusus pakon signifikan meningkat bani PN na hurang OXPHOS, sementara reaktivitas PCx terutama terbatas hubani sel glial Bergmann na berdekatan humbani kontrol (Gambar 3B). Laho manguji secara fungsional peningkatan PCx na iperhatihon, hanami mangubati irisan serebelum akut marhiteihon [1-13C]pyruvate tracer. Sanggah piruvat ioksidasi piruvat dehidrogenase (PDH), label isotopni magou, tapi ipamasuk hubagas perantara siklus TCA sanggah piruvat imetabolisme marhitei reaksi pembuluh darah (Gambar 3D). Bani na mendukung data proteomik nami, ididah hanami do buei penanda humbani pelacak on bani asam aspartat irisan Mfn2cKO, sementara asam sitrat pakon asam malat pe memiliki kecenderungan sedang, pori pe lang signifikan (Gambar 3D).
Bani neuron dopamin ni tikus MitoPark na mardisfungsi mitokondria na ibahen neuron dopamin na secara khusus mansedahon gen faktor transkripsi mitokondria A (Tfam) (Gambar S6B), ekspresi PCx pe secara signifikan domma iatur hu atas (31), na pataridahkon anggo arteriosklerosis asam aseton Kejadian ni naborit on iatur sanggah gangguan fungsi neuron OXPHOS ibagas angkula. Porlu do ibotoh hita bahwa domma jumpah bahwa enzim unik (32-34) na boi iekspresihon bani neuron na boi marpardomuan pakon arteriosklerosis secara signifikan i-up-regulate bani PN na hurang OXPHOS, misalni propionyl-CoA carboxylase (PCC-A), Malonyl-CoA mangubah propionyl-CoA-CoA mitoconyl pakon succic-A-CoA enzim 3 (ME3), na peran utamani aima laho mambuat piruvat humbani malat (Gambar 3, A pakon C) (33, 35). Leganni ai, jumpah hanami do peningkatan na signifikan bani enzim Pdk3, na memfosforilasi janah mambahen inaktif PDH (36), sementara lang dong perubahan na terdeteksi bani enzim Pdp1 na mengaktifkon PDH atap kompleks enzim PDH ai sandiri (Gambar 3A). Secara konsisten, bani Mern2cKO PNs, fosforilasi subunit α1 α (PDHE1α) komponen piruvat dehidrogenase E1 kompleks PDH i Ser293 (na itanda menghambat aktivitas enzim PDH) meningkat (Gambar S6C) (Gambar S6C). Piruvat lang dong akses pembuluh darah.
Ujungni, jumpah hanami ma bahwa jalur super biosintesis serin pakon glisin, siklus folat mitokondria (1C) na terkait pakon biosintesis prolin (Gambar 1G pakon Gambar S5C) haganupan domma signifikan iatur hu atas, mangihutkon laporan, sanggah proses aktivasi. Jaringan na i sekitarni iaktifkon marhiteihon disfungsi mitokondria (5-7). Analisis konfokal na mendukung data proteomik on pataridahkon bahwa bani PN na lang dong OXPHOS, irisan serebelum tikus na marumur 8 minggu ibahen serin hidroksimetiltransferase 2 (SHMT2), enzim kunci siklus folat mitokondria. Respon imun na signifikan (Gambar S5D). Bani 13 irisan serebelum akut na i inkubasi CU-glukosa, percobaan pelacakan metabolisme selanjutni memastikan up-regulasi biosintesis serin pakon prolin, na pataridahkon bahwa fluks isoform karbon hubagas serin pakon prolin meningkat (Gambar S5E). Halani reaksi na ipromosihon GLS pakon GPT2 bertanggung jawab bani sintesis glutamat humbani glutamin pakon transaminasi antara glutamat pakon α-ketoglutarat, peningkatan ni sidea pataridahkon bahwa neuron na hurang OXPHOS memiliki peningkatan permintaan glutamat, on mungkin bertujuan laho mempertahankon peningkatan biosintesis proline (Gambar S5). Berbeda pakon parubahan on, analisis proteomik astrosit serebelum humbani tikus Mfn2cKO spesifik PN pataridahkon bahwa jalur on (termasuk haganup antiperoksidase) lang berubah secara signifikan bani ekspresi, sehingga pataridahkon Pengalihan metabolisme on selektif hubani PN na terdegradasi (Gbr. S6, D ronsi G).
Singkatni, analisis on pataridahkon pola aktivasi temporal na berbeda secara signifikan humbani jalur metabolisme tertentu bani PN. Hassi pe fungsi mitokondria neuronal na lang normal boi do mambahen aterosklerosis dini pakon remodeling 1C (Gambar 3E pakon Gambar S5C), bahkan perubahan na boi iprediksi bani ekspresi kompleks I pakon IV, perubahan sintesis serin de novo pitah taridah bani tahap akhir. Disfungsi OXPHOS (Gambar 3E pakon Gambar S5C). Hasil on mendefinisihon proses berurutan ija respon mitokondria (siklus 1C) pakon sitoplasma (biosintesis serin) na ibahen stres secara sinergis pakon peningkatan aterosklerosis bani siklus TCA laho membentuk kembali metabolisme saraf.
PN na hurang OXPHOS na marumur 8 minggu boi mampartahankon aktivitas eksitasi frekuensi tinggi pakon mengalami rekoneksi metabolisme na signifikan laho mangimbangi disfungsi mitokondria. Penemuan on mambahen sada kemungkinan na menarik bahwa age bani panorang on, sel-sel on boi do homa manjalo intervensi terapeutik laho menunda atap mencegah neurodegenerasi. Tarlambat. Isolsoli hanami do kemungkinan on marhitei dua intervensi independen. Bani metode na parlobei, hanami merancang vektor virus adeno-associated (AAV) na bergantung hubani Cre ase MFN2 boi secara selektif iekspresihon bani PN na hurang OXPHOS in vivo (Gambar S7A). AAV na mengkode MFN2 pakon gen reporter fluoresen mCherry (Mfn2-AAV) domma iverifikasi bani kultur neuron primer in vitro, na mambahen MFN2 iekspresihon ibagas cara na bergantung hubani Cre pakon menyelamatkon morfologi mitokondria, sehingga mencegah neuromutasi bani neuron Mfn2cKO (Gambar S7, B, B pakon D). Dob ai, ibahen hanami ma percobaan in vivo laho padaskon Mfn2-AAV na marumur 8 minggu secara stereotaktis hubani korteks serebelum Mfn2cKO pakon tikus kontrol, janah ipareksa hanami ma tikus na marumur 12 minggu (Gambar 4A). Tikus Mfn2cKO na irawat matei (Gambar 1, A pakon B) (16). Transduksi virus in vivo mangkorhon ekspresi selektif PN bani piga-piga lingkaran serebelum (Gambar S7, G pakon H). Suntikan AAV kontrol na pitah mengekspresihon mCherry (Ctrl-AAV) lang marpangkorhon na signifikan bani tingkat neurodegenerasi bani binatang Mfn2cKO. Sebalikni, analisis Mfn2cKOs na itransduksi pakon Mfn2-AAV pataridahkon efek perlindungan na signifikan humbani lapisan sel PN (Gambar 4, B pakon C). Secara khusus, kepadatan neuron songon na lang boi ibedakan humbani binatang kontrol (Gambar 4, B pakon C, pakon Gambar S7, H pakon I). Ekspresi MFN1 tapi lang MFN2 sama-sama efektif laho menyelamatkon kematian saraf (Gambar 4C pakon Gambar S7, C pakon F), na pataridahkon bahwa ekspresi MFN1 ektopik boi secara efektif melengkapi hurangni MFN2. Analisis selanjutni bani tingkat PN tunggal pataridahkon bahwa Mfn2-AAV sebagian besar menyelamatkan ultrastruktur mitokondria, menormalkan tingkat mtDNA, dan membalikkan ekspresi tinggi penanda anti-angiogenesis PCx (Gambar 4, C hingga E ). Pemeriksaan visual tikus Mfn2cKO na iselamatkon sanggah istirahat pataridahkon anggo postur pakon gejala motorik ni sidea (gerakan S1 ronsi S3) domma lambin dear. Kesimpulanni, percobaan on pataridahkon bahwa penundaan reintroduksi MFN2 hubani PNs na parah hurangni OXPHOS domma sungkup laho mambalikkon konsumsi mtDNA pakon manginduksi aterosklerosis, sehingga mencegah degenerasi akson pakon kematian saraf in vivo.
(A) Sada skema na pataridahkon jadwal percobaan laho manyuntikkon AAV na mankodehon MFN2 sanggah jalur metabolisme na ipatugah iaktifkon. (B) Gambar konfokal representatif humbani irisan serebelum na marumur 12 minggu na itransduksi bani 8 minggu bani tikus Mfn2cKO pakon ilabelhon antibodi anti-Calbindin. Kanan: Skala serat akson. Skala zoom akson aima 450 pakon 75 μm. (C) Kiri: Kuantifikasi kepadatan sel Purkinje bani lingkaran transduksi AAV (AAV+) (analisis varians satu arah; n = 3 tikus). Kanan: analisis fokus mtDNA bani PN na i transduksi bani minggu 12 (uji t na lang marpasangan; n = 6 sel humbani tolu tikus). * P <0.05; ** P <0.01. (D) Mikrograf elektron transmisi representatif PN bagian serebelum Mfn2cKO na itransduksi marhitei vektor virus na ipatugah. Topeng na marwarna merah jambu manggambarhon ianan na iiankon dendrit, pakon kotak na martitik-titik na marwarna kuning manggambarhon zoom na ibere i siamun; n manggambarhon inti. Bar skala, 1μm. (E) pataridahkon contoh pewarnaan PCx bani PN na i transduksi bani 12 minggu. Bar skala, 20μm. OE, ekspresi na marlobih-lobih; FC, lipat perubahan.
Ujungni, ipareksa hanami do pentingni kelangsungan hidup sel na ibahen peroksidase bani PN na domma mangahapkon disfungsi OXPHOS. Ibahen hanami do mCherry na mankodehon AAV-shRNA (RNA jepit rambut na pondok) na khusus manargetkon mRNA PCx tikus (AAV-shPCx), anjaha isuntikkon hanami ma virus atap kontrol na icampur-campur (AAV-scr) hubagas otak ni tikus Mfn2cKO. Suntikan ai ibahen bani minggu paompatkon umur (Gambar 5A) laho mandapotkon knockdown PCx na efektif bani periode sanggah ekspresi PCx meningkat (Gambar 3C) pakon lapisan sel PN na utuh ope (Gambar 1A). Porlu do ibotoh hita anggo manrobohkon PCx (Gambar S8A) mambahen percepatan na signifikan bani hamateian PN, na terbatas hubani cincin na terinfeksi (Gambar 5, B pakon C). Ase boi iarusi hita mekanisme efek metabolisme na ibahen PCx up-regulation, iparlajari hita ma status redoks ni PN dob PCx knockdown pakon biosensor optik na imediasi AAV Grx1-roGFP2 na iekspresihon secara serentak (Gambar S8, B ronsi D) laho mangevaluasi glutathione Perubahan relatif potensi peptida redox (383). Dob ai, ibahen hanami ma mikroskop pencitraan seumur hidup fluoresensi dua foton (FLIM) bani irisan otak akut Mfn2cKO na marumur 7 minggu atap littermates kontrol laho mangidah perubahan potensial bani status redoks sitoplasma dobkonsi iverifikasi kondisi FLIM (Gambar S8, E ronsi G). Analisis ai pataridahkon peningkatan na signifikan bani keadaan oksidasi ni sada Mfn2cKO PN na lang dong ekspresi PCx, na legan humbani neuron kontrol atap Mfn2cKO PN na pitah mengekspresihon shRNA na i-scrambled (Gambar 5, D pakon E). Sanggah ekspresi PCx i-down-regulate, persentase Mfn2cKO PNs na pataridahkon keadaan na sangat teroksidasi meningkat lobih humbani tolu hali (Gambar 5E), na pataridahkon bahwa PCx up-regulation mampartahankon kapasitas redoks neuron na degeneratif.
(A) Sada skema na pataridahkon jadwal percobaan laho manyuntikkon AAV na mankode shPCx sanggah jalur metabolisme na ipatugah iaktifkon. (B) Foto konfokal representatif bagian serebelum na marumur 8 minggu bani tikus Mfn2cKO na itransduksi pakon ilabelhon antibodi anti-kalsineurin bani 4 minggu. Bar skala, 450μm. (C) Kuantifikasi kepadatan sel Purkinje bani loop na itransduksi AAV (analisis varians satu arah; n = 3 ronsi 4 tikus). Data ipatugah songon rata-rata±SEM; ***P<0.001. (D) Gambar FLIM na mewakili pataridahkon umur rata-rata PN na marumur 7 minggu na mengekspresihon sensor redoks glutation Grx1-roGFP2 bani kondisi eksperimen na dob itontuhon. LUT (tabel pencarian) rasio: interval waktu kelangsungan hidup (ibagas pikodetik). Bar skala, 25μm. (E) Histogram pataridahkon distribusi nilai seumur hidup Grx1-roGFP2 humbani (D) (n=158 ronsi 368 sel bani dua tikus bani ganup kondisi). Bagan pie i atas tiap histogram: pataridahkon bilangan sel na marnilai umur na signifikan lobih dokah (merah, teroksidasi) atap pondok (biru, markurang), na lobih humbani 1 SD humbani nilai umur rata-rata bani CTRL-AAV-scr. (F) Model na iusulhon pataridahkon efek perlindungan humbani peningkatan PCx neuronal.
Haganup, data na ibere hanami ijon pataridahkon bahwa ekspresi ulang MFN2 boi sepenuhni menyelamatkon PN na domma lanjut pakon defisiensi OXPHOS na parah, depletion mtDNA na parah, pakon morfologi songon ista na sangat abnormal, sehingga mambere kemajuan na torus age bani naborit na domma lanjut. Neurodegenerasi mambere bukti na boi ibalikkon pasal tahap paima matei sel. Tingkat fleksibilitas metabolisme on lambin itekanhon marhiteihon kemampuan ni neuron laho manginduksi aterosklerosis (sada kabel ulang siklus TCA), na menghambat ekspresi PCx bani PN na hurang OXPHOS pakon meningkathon kematian sel, sehingga berperan sebagai perlindungan (Gambar 5F).
Bani penelitian on, hanami mambere bukti bahwa respon PNs hubani disfungsi OXPHOS aima secara bertahap konvergensi hubani aterosklerosis siklus TCA marhiteihon jalur aktivasi diferensial na iaktifkon program metabolisme. Ikonfirmasi hanami do analisis proteomik marhiteihon buei metode pelengkap pakon mangungkapkon anggo sanggah itantang disfungsi mitokondria na parah, neuron memiliki bentuk elastisitas metabolisme na lape ongga ibotoh. Na mambahen tarsonggot hanami, ganup proses rewiring lang sai menandai keadaan metabolisme terminal na mangiringkon neurodegenerasi secara bertahap pakon lang boi ibalikkon, tapi data nami patugahkon bahwa ai boi do gabe neuron pemeliharaan bahkan bani tahap paima kematian sel Mekanisme kompensasi fungsional. Hasil on pataridahkon bahwa neuron memiliki tingkat plastisitas metabolisme na lumayan banggal bani angkula. Fakta on mambuktihon bahwa reintroduksi MFN2 na i pudian ni ari boi mambalikkon ekspresi penanda metabolisme kunci pakon mencegah degenerasi PN. Sebalikni, ai menghambat aterosklerosis pakon mempercepat saraf. transseksual.
Sada humbani hasil penelitian nami na paling menarik aima anggo PN na hurang OXPHOS boi mangubah metabolisme siklus TCA marhitei na mangatur enzim na secara khusus merangsang arteriosklerosis. Pengaturan ulang metabolisme aima sada fitur umum sel kanker, deba humbani ai marpangunsandeian hubani glutamin laho melengkapi perantara siklus TCA laho menghasilhon setara reduksi, na mendorong rantai pernapasan pakon mempertahankon produksi prekursor biosintesis lipid pakon nukleotida (39 , 40). Sada penelitian baru-baru on pataridahkon bahwa bani jaringan tepi na mangahapkon disfungsi OXPHOS, rekoneksi metabolisme glutamin/glutamat aima sada fitur na menonjol (5, 41), ija arah masukni glutamin hu siklus TCA bergantung hubani Halani parah ni luka OXPHOS (41). ). Tapi, hurang do bukti na jelas pasal kesamaan plastisitas metabolisme saraf bani angkula pakon kemungkinan relevansini bani konteks naborit. Bani sada penelitian in vitro na baru-baru on, neuron kortikal primer ipatuduhkon laho memobilisasi kolam glutamat untuk neurotransmisi, sehingga mendorong metabolisme oksidatif pakon aterosklerosis ibagas kondisi stres metabolisme (42). Porlu do ibotoh hita anggo i toruh ni penghambatan farmakologis enzim siklus TCA suksinat dehidrogenase, karboksilasi piruvat ihaporsayai boi mampartahankon sintesis oksaloasetat bani neuron granul serebelum na ibudidayahon (34). Tapi, relevansi fisiologis ni mekanisme on hubani jaringan otak (ija aterosklerosis ihaporsayai terutama terbatas hubani astrosit) totap do memiliki signifikansi fisiologis na penting (43). Bani kasus on, data nami pataridahkon bahwa PN na maseda halani OXPHOS bani angkula boi iubah gabe degradasi BCAA pakon karboksilasi piruvat, na gabe dua sumber utama suplementasi perantara kolam TCA. Hassi pe domma iusulhon kontribusi katabolisme BCAA hubani metabolisme energi saraf, dihut ma ai peran ni glutamat pakon GABA bani neurotransmisi (44), lape dong bukti mekanisme on in vivo. Halani ai, urah do marpandapot anggo PN na lang marfungsi boi secara otomatis mangimbangi konsumsi perantara TCA na idorong proses asimilasi marhitei na meningkatkon aterosklerosis. Secara khusus, peningkatan PCx mungkin ihaporluhon laho mempertahankon peningkatan permintaan asam aspartik, na iusulhon bani sel na berkembang biak na mardisfungsi mitokondria (45). Tapi, analisis metabolomik nami lang pataridahkon parubahan na signifikan bani tingkat steady-state asam aspartat bani Mfn2cKO PNs (Gambar S6A), na ra do mencerminhon pemanfaatan metabolisme asam aspartat na berbeda antara sel na berkembang biak pakon neuron pasca-mitosis. Hassi pe mekanisme na tepat humbani PCx naik bani neuron na lang marfungsi in vivo lape boi itandahon, hanami pataridahkon bahwa respon prematur on berperan penting laho manramotkon keadaan redoks neuron, na dob ipatuduhkon bani percobaan FLIM bani irisan serebelum. Secara khusus, mencegah PNs humbani na mangatur PCx ​​boi do mambahen keadaan na lobih teroksidasi pakon mempercepat kematian sel. Pengaktifan degradasi BCAA pakon karboksilasi piruvat lang cara laho mancirihon jaringan tepi disfungsi mitokondria (7). Halani ai, sidea songon fitur prioritas ni neuron na hurang OXPHOS, pori pe lang pitah fitur ai, na porlu bani neurodegenerasi. .
Penyakit serebelum aima jenis penyakit neurodegeneratif na heterogen na somal taridah songon ataksia janah gati mambahen maseda PN (46). Populasi neuron on rentan tumang hubani disfungsi mitokondria halani degenerasi selektif ni sidea bani tikus domma sungkup laho mereproduksi buei gejala motorik na gabe ciri khas ni ataksia spinocerebellar ni jolma (16, 47, 48). Domu hubani laporan, model tikus transgenik pakon gen mutan berhubungan pakon ataksia spinocerebellar ni jolma pakon memiliki disfungsi mitokondria (49, 50), na menekanhon pentingni mamparlajari konsekuensi defisiensi OXPHOS bani PNPH. Halani ai, on sangat cocok laho mangisolasi pakon mamparlajari populasi neuron na unik on secara efektif. Tapi, halani PNs sangat sensitif hubani tekanan pakon menyumbang proporsi na rendah humbani ganup populasi sel serebelum, bani buei penelitian berbasis omics, pemisahan selektif humbani sidea sebagai sel utuh totap do gabe aspek na menantang. Hassi pe hampir lang mungkin boi mandapotkon hurangni kontaminasi na mutlak bani jenis sel na legan (tarlobih jaringan dewasa), hanami padomuhon langkah disosiasi na efektif pakon FACS laho mandapotkon jumlah neuron na layak na cukup untuk analisis proteomik hilir, pakon memiliki cakupan protein na cukup tinggi (hira-hira 3000 protein) ibandingkon pakon data set serebelum na adong (515). Marhitei na manramotkon kelangsungan hidup sel na gok, metode na ibere hanami ijon mambahen hanami lang pitah boi mamareksa parubahan bani jalur metabolisme i mitokondria, tapi dihut do homa mamareksa parubahan bani rekan-rekan sitoplasma ni, na melengkapi penggunaan tag membran mitokondria laho pabanggalhon jenis sel Metode na baru bani bilangan mitokondria bani jaringan kompleks (2555). Metode na ipatugah hanami lang pitah marpardomuan hubani penelitian sel Purkinje, tapi boi do urah iterapkon hubani jenis sel aha pe laho mangatasi perubahan metabolisme bani otak na boritan, termasuk model disfungsi mitokondria na legan.
Ujungni, domma itanda hanami sada jendela terapeutik bani proses penataan ulang metabolisme on na boi sepenuhni mambalikkon tanda-tanda kunci stres seluler pakon mancegah degenerasi saraf. Halani ai, mangarusi implikasi fungsional ni rewiring na ipatugah ijon boi mambere wawasan mendasar hubani kemungkinan pengobatan laho manramotkon daya tahan saraf sanggah disfungsi mitokondria. Penelitian na laho roh na martujuan laho mambedah parubahan metabolisme energi bani jenis sel otak na legan porlu laho mangungkapkon secara lengkap penerapan prinsip on hubani naborit saraf na legan.
Tikus MitoPark domma ipatugah hinan (31). Tikus C57BL/6N pakon gen Mfn2 na mangapit loxP domma ipatugah hinan (18) pakon ipersilangkon pakon tikus L7-Cre (23). Keturunan heterozigot ganda na ihasilhon dob ai i persilangkan pakon tikus Mfn2loxP/Mfn2loxP homozigot laho menghasilhon knockout gen khusus Purkinje untuk Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Bani sada subset parkawinan, Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP alel (stop-mtYFP) iperkenalhon marhiteihon persilangan tambahan (20). Haganup prosedur binatang ibahen domu hubani pedoman Eropa, nasional pakon lembaga janah domma isetujui LandesamtfürNatur hun Umwelt pakon Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Jerman. Horja bani binatang mangihutkon bimbingan ni Federasi Eropa Asosiasi Ilmu Hewan Laboratorium.
Dobkonsi i bius dislokasi serviks ni naboru na boratan rumah, isolasi ma embrio tikus (E13). Korteks ai i bedah bani Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) na itambahi 10 mM Hepes pakon ibere hubani Dulbecco's Modified Eagle's Medium na marisi papain (20 U/ml) pakon sistein (1μg/ml). Inkubasi ma jaringan ai ibagas DMEM) pakon disosiasihon ma ai marhitei pencernaan enzimatik. Ml) bani 37°C sadokah 20 menit, dob ai igiling secara mekanis ibagas DMEM na itambahi 10% serum janin sapi. Sel-sel itanom bani penutup kaca na ilapisi polilisin bani kepadatan 2×106 per piring kultur 6 cm atap bani kepadatan 0,5×105 sel/cm2 untuk analisis pencitraan. Dob 4 jam, media ai igantihkon pakon media bebas serum Neurobasal na marisi suplemen B27 1% pakon GlutaMax 0,5 mM. Neuron ai dob ai ipertahankon bani 37°C pakon 5% CO2 sadokah percobaan, anjaha ibere mangan sahali saminggu. Ase boi manginduksi rekombinasi in vitro, 3μl (piring kultur 24-sumur) atap 0,5μl (piring 24-sumur) humbani vektor virus AAV9 na i toruh on ipakei laho mangubati neuron bani ari paduahon in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, nomor katalog 105530-AAV9) pakon AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, nomor katalog 105545-AAV9).
DNA komplementer Mfn1 pakon Mfn2 tikus (na idapot humbani plasmid Addgene #23212 pakon #23213, masing-masing) itanda marhitei urutan V5 (GKPIPNPLLGLDST) bani C-terminus, anjaha ipadomu pakon mCherry ibagas bingkai marhitei urutan T2A. Grx1-roGFP2 aima sada sibere-bere humbani Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Marhitei na manggantihon kaset tdTomato mamakei metode kloning konvensional, kaset ai isubkloning hu tulang punggung pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (nomor referensi Addgene 28306) laho mambahen pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-G FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 pakon pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 vektor. Strategi na sarupa ipakei laho mambahen vektor kontrol pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Ase boi mambahen konstruksi AAV-shPCx, porlu do vektor AAV plasmid (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), na marisi urutan DNA na mankodehon shRNA na manargetkon PCx tikus (5′CTTTCGCTAGCTAGGCTAAGGCTAAGGCTAGACTTAGA 3′) Ibagas kontrol promotor U6, mCherry ipakei ibagas kontrol promotor CMV. Produksi vektor AAV tambahan ibahen domu hubani petunjuk pabrik (Cell Biolabs). Singkatni, pakei ma plasmid transfer na mamboan mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) secara sementara Transfeksi sel 29A-MFN2-V5-MFN2-V5 mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) atap Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) gen pengkodean, sonai homa pengkodean protein kapsid AAV1 pakon plasmid kemasan protein aksesoris, mamakei metode kalsium fosfat. Supernatan virus kasar idapot marhitei siklus beku-cair ibagas mandi es kering/etanol pakon sel na ilisis ibagas saline penyangga fosfat (PBS). Vektor AAV imurnihkon marhitei ultrasentrifugasi gradien iodixanol na lang berkesinambungan (24 jam bani 32.000 rpm pakon 4°C) pakon ipekat mamakei filter sentrifugal Amicon ultra-15. Titer genom AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 salinan genom (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX songon na dob ipatugah hinan (iukur secara kuantitatif PCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) pakon AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml).
Neuron primer i kikis ibagas PBS 1x na milas songon es, i pelet, dob ai i homogenhon ibagas 0,5% Triton X-100 / 0,5% natrium deoksikolat/PBS penyangga lisis na marisi fosfatase pakon penghambat protease (Roche). Pangukuran protein ibahen mamakei assay asam bicinchoninic (Thermo Fisher Scientific). Protein-protein ai dob ai ipisahon marhitei elektroforesis gel SDS-poliakrilamida, dob ai i-blot hubani membran poliviniliden fluorida (GE Healthcare). Blokir ma ianan na lang spesifik anjaha inkubasi ma pakon antibodi primer (idah Tabel S1 ase lambin torang) ibagas susu 5% ibagas TBST (saline Tris-buffered pakon Tween), langkah-langkah pancucian pakon antibodi sekunder ibagas TBST Inkubasi. Inkubasi pakon antibodi primer saborngin i +4°C. Dobkonsi iburihi, pakei ma antibodi sekunder ai sadokah 2 jam bani suhu kamar. Dob ai, marhitei na manginkubasi blot na sarupa pakon antibodi anti-β-aktin, pemuatan na sarupa domma isahkon. Deteksi marhitei na mangubah gabe chemiluminescence pakon meningkatkon chemiluminescence (GE Healthcare).
Neuron na dob itanom hinan bani penutup kaca iperbaiki marhitei 4% paraformaldehida (PFA)/PBS bani titik waktu na dob itontuhon bani suhu kamar sadokah 10 menit. Penutup ai parlobei ipermeasi pakon 0,1% Triton X-100/PBS sadokah 5 menit bani suhu kamar, dob ai ibagas penyangga penghalang [3% albumin serum sapi (BSA)/PBS]. Bani ari paduahon, coverslips icuci marhitei penyangga penghalang janah iinkubasi pakon antibodi sekunder konjugasi fluorophore na sosok sadokah 2 jam bani suhu kamar; ujungni, sampel ai iburihi dear-dear ibagas PBS pakon 4′,6-diamidino-2 -Phenylindole (DAPI) na iwarnai lawan dob ai iperbaiki bani slide mikroskop pakon Aqua-Poly/Mount.
Tikus (jantan pakon boru-boru) i bius marhiteihon suntikan intraperitoneal ketamin (130 mg/kg) pakon xylazine (10 mg/kg) pakon ibere secara subkutan pakon analgesik carprofen (5 mg/kg), pakon ibahen bani alat stereotaktik (Kopf) na ilengkapi pakon papan hangat. Pataridahkon ma tangkog ai anjaha pakei ma bor gigi laho menipiskon bagian korteks serebelum na sadalan hubani tulang mis (humbani lambda: ikur 1,8, lateral 1, sadalan hubani lobus IV pakon V). Pakei ma jarum suntik na melengkung laho mambahen lubang na etek bani tangkog ase ulang mambahen ganggu pembuluh darah i toruh. Dob ai kapiler kaca na tipis na ibuat ai ipamasuk palan-palan hubagas lubang mikro (humbani -1,3 ronsi -1 i sisi ventral ni dura mater), anjaha 200 ronsi 300 nl AAV isuntikkon hubagas injektor mikro (Narishige) marhitei jarum suntik manual (Narishige) piga-piga hali bani tekanan na rendah sadokah 10 menit ronsi 20 menit. Dobkonsi infus, ibahen ma kapiler ai 10 menit nari ase boi virus ai merambat. Dobkonsi kapiler ai itarik, ijait ma kulit ai dear-dear ase ulang radang luka janah boi malum binatang ai. Binatang ai irawat marhitei obat analgesik (caspofen) piga-piga ari dobkonsi operasi, bani panorang ai kondisi fisik ni sidea ipantau do dear-dear dob ai i eutanasia bani panorang na dob itontuhon. Haganup prosedur idalankon domu hubani pedoman Eropa, nasional pakon lembaga janah domma isetujui LandesamtfürNatur hun Umwelt pakon Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Jerman.
Binatang ai ibius marhiteihon ketamin (100 mg/kg) pakon xylazine (10 mg/kg), dob ai jantungni iperfusi marhiteihon 0,1 M PBS lobei, dob ai marhiteihon 4% PFA ibagas PBS. Jaringan ai i bedah janah iperbaiki ibagas 4% PFA/PBS saborngin bani suhu 4°C. Sada pisou na margetar (Leica Microsystems GmbH, Wina, Austria) ipakei laho pasirsirhon bagian sagittal (tebal 50 μm) humbani otak na totap ibagas PBS. Kecuali dong na legan, pewarnaan bagian na mengambang bebas ibahen songon na dob ipatugah i atas (13) bani suhu kamar pakon pengadukan. Singkatni, parlobei, irisan na dapot ipermeabilisasi marhitei 0,5% Triton X-100/PBS sadokah 15 menit bani suhu kamar; bani piga-piga epitop (Pcx pakon Shmt2), marhiteihon penyangga tris-EDTA bani 80°C (PH 9) panaskon ma irisan ai sadokah 25 menit sedo langkah on. Dob ai, bagian-bagian ai i inkubasi pakon antibodi primer (idah Tabel S1) ibagas penyangga penghalang (3% BSA/PBS) bani suhu 4°C saborngin marhitei na mangaduk. Patarni ai, bagian-bagian ai icuci marhitei penyangga penghalang janah iinkubasi marhitei antibodi sekunder konjugasi fluorofor na sosok sadokah 2 jam bani suhu kamar; ujungni, bagian-bagian ai iburihi dear-dear ibagas PBS, iwarnai pakon DAPI, dob ai iperbaiki marhitei AquaPolymount Bani slide mikroskop.
Sada mikroskop konfokal pemindaian laser (TCS SP8-X atap TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) na ilengkapi laser cahaya putih pakon laser ultraviolet 405 dioda ipakei laho manggambarhon sampel. Marhitei na mambahen fluorophore marmalas ni uhur pakon patumpuhon sinyal marhitei Hybrid Detector (HyDs), LAS-X software ipakei laho patumpuhon gambar na martumpu na sadalan hubani sampling Nyquist ibagas mode berurutan: bani panel non-kuantitatif, sinyal na sangat dinamis (misalni, bani sel somatik pakon dendrit) mtYFP D FPD ase boi mendeteksi Hybrid Detectors secara kanan mode). Gating humbani 0.3 das hubani 6 ns iterapkon laho mangurangi latar belakang.
Pencitraan real-time humbani sel na iurutkon. Dob ipilih bani media Neurobasal-A na marisi 1% suplemen B27 pakon 0,5 mM GlutaMax, sel-sel mintor itanom bani slide kaca na ilapisi poli-l-lisin (μ-Slide8 Dear, Ibidi, nomor katalog 80826), dob ai ijaga ma ai bani 37°C pakon 15% CO sadokah sajam ase sel ai boi manotap. Pencitraan real-time ibahen bani mikroskop konfokal pemindaian laser Leica SP8 na ilengkapi laser putih, HyD, lensa objektif minyak 63×[1.4 bukaan numerik (NA)] pakon tahap pemanasan.
Tikus ai mintor i bius marhiteihon karbon dioksida dob ai iponggolhon ulu, otakni mintor ipadaoh humbani tangkog, anjaha iponggol gabe 200μm tebalni (untuk percobaan pelabelan 13C) atap 275μm tebalni (untuk dua percobaan foton) bagian sagittal na igoki bahan-bahan na i toruh on Es krim (HM-605, Themorific, Themotif, Scientific Walldorf, Jerman) igoki pakon zat-zat na i toruh on: 125 mM borgoh songon es, jenuh karbon (95% O2 pakon 5% CO2) Ca2 rendah + cairan serebrospinal buatan (ACSF) NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM penyangga natrium fosfat, NaCl, 2,25 mM, glusa 0.5 mM CaCl2 pakon 3.5 mM MgCl2 (tekanan osmotik 310 ronsi 330 mmol). Pindahi ma irisan otak na dapot hu kamar pra-inkubasi na marisi Ca2 + ACSF na lobih gijang (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM penyangga natrium fosfat, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukosa, 10 mM CaCl pakon 20 mM). MgCl2) Medium) pH 7.4 pakon 310 ronsi 320 mmol).
Bani proses pencitraan, irisan-irisan ai ipindahi hu ruang pencitraan khusus, anjaha percobaan ai ibahen ibagas perfusi ACSF na torus bani suhu na totap 32° ronsi 33°C. Sada mikroskop pemindaian laser multifoton (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) na ilengkapi pakon lensa objektif Leica 25x (NA 0,95, bah), Ti: Sapphire laser (Chameleon Vision II, Coherent) ipakei laho mambahen pencitraan irisan. Modul FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM humbani Grx1-roGFP2. Parubahan bani keadaan redoks sitoplasma PN iukur marhitei FLIM dua foton bani irisan otak sagital, ija biosensor Grx1-roGFP2 manargetkon PN. Bani lapisan PN, bidang perolehan ipilih hira-hira 50 ronsi 80 μm i toruh ni permukaan irisan laho memastikan dong PN na layak (ai ma, hurangni struktur manik-manik atap perubahan morfologis saraf i sepanjang dendrit) pakon sensor roGFP2 positif ganda pakon AAV na mengkodehon shRNA PCx atap urutan kontrolni (masing-masing koekspresi mCherry). Patumpu gambar tumpukan tunggal marhitei 2x zoom digital [panjang gelombang eksitasi: 890 nm; 512 nm 512 piksel]. Deteksi: HyD internal, kelompok filter fluorescein isothiocyanate (FITC)] pakon rata-rata gambar ibagas 2 ronsi 3 menit ipakei laho memastikan domma sungkup foton na ipatumpu (1000 foton total) untuk pas kurva. Sensitivitas probe Grx1-roGFP2 pakon verifikasi kondisi FLIM ibahen marhitei na memantau nilai umur roGFP2 sanggah manambahkon 10 mM H2O2 eksogen hubani perfusi ACSF (ase maksimal oksidasi, mangkorhon peningkatan umur), dob ai manambahkon 2 mM dithiothreit mangurangi (mangkorhon pengurangan tingkat penurunan umur) (Gambar S8, D das hubani G). Pakei ma perangkat lunak FLIMfit 5.1.1 laho menganalisa hasil na dapot, paskon ma kurva peluruhan eksponensial tunggal humbani ganup gambar hubani IRF na isukat (fungsi respon instrumen), anjaha χ2 hira-hira 1. Laho mangetong umur ni sada PN, masker i sekitar badan saraf igambar secara manual, janah mangukur rata-rata umur bani ganup masker ipakei.
Analisis potensi mitokondria. Dobkonsi bagian akut i inkubasi pakon 100 nM TMRM na langsung itambahkon hubani ACSF na dob iperfusi sadokah 30 menit, perubahan potensial mitokondria PNs iukur marhitei mikroskop dua foton. Pencitraan TMRM ibahen marhitei na mambahen heboh probe bani 920 nm pakon mamakei HyD internal (tetramethylrhodamine isothiocyanate: 585/40 nm) laho patumpuhon sinyal; marhitei na mamakei panjang gelombang eksitasi na sarupa tapi mamakei HyD internal na legan (FITC :525/50) laho manggambarhon mtYFP. Pakei ma plug-in Kalkulator Gambar ImageJ laho mangevaluasi potensi mitokondria bani tingkat sel tunggal. Singkatni, persamaan plug-in: sinyal = min (mtYFP, TMRM) ipakei laho mangindahi daerah mitokondria na pataridahkon sinyal TMRM i Purkinje Somali bani gambar konfokal tumpukan tunggal saluran na sadalan. Dob ai, luas piksel bani masker na ihasilhon iukur, dob ai inormalhon bani gambar tumpukan tunggal ambang batas na sadalan hubani saluran mtYFP laho mandapotkon fraksi mitokondria na pataridahkon potensi mitokondria.
Gambar ai i dekonvolusi marhiteihon perangkat lunak Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). Bani gambar ubin na dob ipindai, montase ubin tunggal ibahen mamakei algoritma jahitan otomatis na ipasirsir perangkat lunak LAS-X. Dobkonsi kalibrasi gambar, pakei ma ImageJ pakon Adobe Photoshop laho mamproses gambar ai janah menyesuaihon kecerahan pakon kontras secara seragam. Pakei ma Adobe Illustrator laho pasirsirhon grafik.
analisis fokus mtDNA. Jumlah lesi mtDNA iukur bani bagian serebelum na marlabel antibodi dompak DNA marhitei mikroskop konfokal. Ganup daerah target ibahen bani badan sel pakon inti ni ganup sel, anjaha daerah ai iparetongkon mamakei plug-in Multi Measure (perangkat lunak ImageJ). Kurangi luas inti humbani luas badan sel ase dapot luas sitoplasma. Ujungni, plug-in Analyze Particles (perangkat lunak ImageJ) ipakei laho mangukur secara otomatis titik DNA sitoplasma na pataridahkon mtDNA bani gambar ambang batas, anjaha hasil na dapot inormalhon hubani rata-rata PN tikus CTRL. Hasilni ipatugah songon bilangan rata-rata nukleosida per sel.
Analisis ekspresi protein. Pakei ma plug-in Kalkulator Gambar ImageJ laho mangevaluasi ekspresi protein i PN bani tingkat sel tunggal. Singkatni, bani gambar konfokal lapisan tunggal saluran na sadalan, marhiteihon persamaan: sinyal = min (mtYFP, antibodi), daerah mitokondria na pataridahkon imunoreaktivitas hubani antibodi tertentu i Purkina itanda. Dob ai, luas piksel bani masker na ihasilhon iukur, dob ai inormalhon bani gambar tumpukan tunggal ambang batas na sadalan hubani saluran mtYFP laho mandapotkon fraksi mitokondria humbani protein na ipatuduh.
Analisis kepadatan sel Purkinje. Plug-in Cell Counter ni ImageJ ipakei laho mangevaluasi kepadatan Purkinje marhitei na mambagi bilangan sel Purkinje na ibilang marhitei ganjang ni cincin serebelum na iiankon sel na ibilang.
Persiapan pakon pangumpulan sampel. Otak humbani kelompok kontrol pakon tikus Mfn2cKO iperbaiki ibagas 2% PFA/2,5% glutaraldehida ibagas 0,1 M penyangga fosfat (PB), dob ai bagian koronal ipasirsir mamakei silia (Leica Mikrosysteme GmbH, Wina, Austria) (Ketebalan 50 ronsi 60 μm) Penyangga perbaikan ibagas 1% PB tetraoksida pakon 1,5% kalium ferrosianida bani suhu kamar sadokah 1 jam. Bagian-bagian ai iburihi tolu hali mamakei bah na dob isuling, dob ai iwarnai pakon 70% etanol na marisi 1% uranil asetat sadokah 20 menit. Bagian-bagian ai dob ai i dehidrasi ibagas alkohol na martingkat janah i tanamkon ibagas Durcupan ACM (Araldite casting resin M) epoxy resin (Electron Microscopy Sciences, nomor katalog 14040) antara slide kaca na ilapisi silikon, dob ai bani 60°C ipolimerisasi ibagas oven sadokah 48 jam. Area korteks serebelum ipilih janah bagian ultrathin 50 nm iponggol bani Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Wina, Austria) pakon ipilih bani kisi-kisi celah tembaga 2×1 mm na ilapisi film polistirena. Bagian-bagian ai iwarnai marhitei larutan uranil asetat 4% ibagas H2O sadokah 10 menit, icuci marhitei H2O piga-piga hali, dob ai marhitei sitrat timah Reynolds ibagas H2O sadokah 10 menit, dob ai icuci marhitei H2O piga-piga hali. Mikrograf ibuat mamakei mikroskop elektron transmisi Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) mamakei kamera digital TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, USA). Jerman).
Bani tikus na hona AAV, otakni ipisahon janah iponggol gabe bagian sagittal tebalni 1 mm, anjaha serebelum ipareksa mamakei mikroskop fluoresensi laho mangindahi cincin na hona AAV (ai ma, mCherry na mengekspresihon). Pitah percobaan ija suntikan AAV mangkorhon efisiensi transduksi na sangat tinggi humbani lapisan sel Purkinje (ai ma hampir ganup lapisan) bani saotikni dua cincin serebelum na marturut-turut do na ipakei. Loop na i transduksi AAV i mikrodiseksi untuk pasca-fiksasi saborngin (4% PFA pakon 2,5% glutaraldehida ibagas penyangga kakao 0,1 M) dob ai iproses selanjutni. Bani EPON embedding, jaringan na totap icuci marhitei 0,1 M penyangga kakao natrium (Applichem), dob ai i inkubasi marhitei 2% OsO4 (os, Layanan Sains; Caco) ibagas 0,1 M penyangga kakao natrium (Applichem) 4 Jam, dob ai iburihi 2 jam. Ulang 3 hali pakon 0,1 M penyangga kokamida. Dob ai, deret etanol na naik ipakei laho manginkubasi tiap larutan etanol bani suhu 4°C sadokah 15 menit laho mendehidrasi jaringan. Jaringan ai ipindahkan hubani propylene oxide pakon i inkubasi saborngin i EPON (Sigma-Aldrich) bani suhu 4°C. Ibahen ma tisu ai hubagas EPON na baru bani suhu kamar sadokah 2 jam, dob ai ibahen ma ai bani 62°C sadokah 72 jam. Pakei ma ultramicrotome (Leica Microsystems, UC6) pakon pisou berlian (Diatome, Biel, Swiss) laho mamotong bagian ultratipis 70 nm, anjaha nodai marhitei 1,5% uranil asetat sadokah 15 menit bani suhu 37°C, dob ai nodai marhitei larutan timah sitrat 4 menit. Mikrograf elektron ibuat mamakei mikroskop elektron transmisi JEM-2100 Plus (JEOL) na ilengkapi Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) pakon perangkat lunak DigitalMicrograph (Gatan). Bani analisis, mikrograf elektron idapot marhitei 5000× atap 10.000× zoom digital.
Analisis morfologis mitokondria. Bani haganup analisis, kontur mitokondria marsada-sada igariskon secara manual bani gambar digital mamakei perangkat lunak ImageJ. Parameter morfologis na berbeda ipareksa. Kepadatan mitokondria ipatugah songon persentase na dapot marhitei na mambagi total luas mitokondria ni ganup sel marhitei luas sitoplasma (luas sitoplasma = luas sel-luas inti sel) × 100. Kebulatan mitokondria iparetongkon marhitei rumus [4π∙(luas/perimeter 2)]. Morfologi ista mitokondria ipareksa janah ibagi gabe dua kategori (“tubular” pakon “blister”) domu hubani bentuk utama ni sidea.
Analisis bilangan pakon kepadatan autofagosom/lisosom. Pakei ma perangkat lunak ImageJ laho manggambarhon kontur ni ganup autofagosom/lisosom bani gambar digital. Luas autofagosom/lisosom ipatugah songon persentase na iparetongkon marhitei na mambagi total luas struktur autofagosom/lisosom ni ganup sel marhitei luas sitoplasma (luas sitoplasma=luas sel-luas inti)×100. Kepadatan autofagosom/lisosom iparetong marhitei na mambagi bilangan total hubani bilangan struktur autofagosom/lisosom per sel (ibagas luas sitoplasma) (luas sitoplasma = luas sel-luas inti).
Pemberian label untuk pemotongan akut pakon persiapan sampel. Bani percobaan na mamorluhon pelabelan glukosa, pindahkan ma irisan otak akut hu ruang pra-inkubasi, na marisi karbon jenuh (95% O2 pakon 5% CO2), Ca2 + ACSF na gijang (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM penyangga natrium fosfat, 2,5 mM NaCl, 200 mM NaCl. d-glukosa, 1,0 mM CaCl 2 pakon 2,0 mM MgCl 2, na iubah hubani pH 7,4 pakon 310 ronsi 320 mOsm), ija glukosa aima 13 C 6- Substitusi glukosa (Eurisotop, nomor katalog CLM-1396). Bani percobaan na mamorluhon pelabelan piruvat, pindahi ma irisan otak akut hubani Ca2 + ACSF na lobih gijang (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM penyangga natrium fosfat, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukosa, 10 mM Ca, pakon 20 MM Ad. MgCl2, sesuaihon hubani pH 7.4 pakon 310 ronsi 320mOsm), dob ai tambahkon 1mM 1-[1-13C]pyruvate (Eurisotop, nomor katalog CLM-1082). Inkubasi ma bagian-bagian ai sadokah 90 menit bani suhu 37°C. Bani ujung ni percobaan, bagian-bagian ai mintor icuci marhitei larutan berair (pH 7,4) na marisi 75 mM amonium karbonat, dob ai i homogenhon ibagas 40:40:20 (v:v:v) asetonitril (ACN): metanol: bah. Dobkonsi bagian-bagian ai i inkubasi bani es sadokah 30 menit, sampel ai i sentrifugasi bani 21.000 g sadokah 10 menit bani suhu 4°C, anjaha supernatan na bening ai ikerangkon bani konsentrator SpeedVac. Pelet metabolit na kering na ihasilhon isimpan bani -80°C ronsi ipareksa.
Analisis kromatografi cair-spektrometri massa humbani 13 asam amino na marlabel C. Bani analisis kromatografi cair-spektrometri massa (LC-MS), pelet metabolit isuspensihon use ibagas 75μl bah kelas LC-MS (Honeywell). Dob isentrifugasi bani 21.000 g sadokah 5 menit bani suhu 4°C, 20 μl supernatan na dob iklarifikasi ipakei laho analisis fluks asam amino, sementara sisa ni ekstrak ai mintor ipakei laho analisis anion (idah i toruh). Analisis asam amino ibahen mamakei protokol derivatisasi benzoil klorida na dob ipatugah nongkan (55, 56). Bani langkah na parlobei, 10μl 100 mM natrium karbonat (Sigma-Aldrich) itambahkon hubani 20μl ekstrak metabolit, dob ai 10μl 2% benzoyl chloride (Sigma-Aldrich) itambahkon hubani LC grade ACN. Sampel ai i vortex tongkin dob ai i sentrifugasi bani 21.000 g sadokah 5 menit bani 20°C. Pindahkon ma supernatan na dob ibersihkon hu botol autosampler 2 ml pakon sisipan kaca kerucut (volume 200 μl). Sampel-sampel ai ipareksa mamakei Acquity iClass ultra-high performance LC system (Waters) na ihubungkon hubani Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) spektrometer massa presisi resolusi tinggi (Thermo Fisher Scientific). Bani analisis, 2μl sampel na dob ibuat isuntikkon hubagas kolom T3 silika kekuatan tinggi 100×1,0 mm (Waters) na marisi partikel 1,8μm. Laju aliran 100μl/min, pakon sistem penyangga terdiri humbani penyangga A (10 mM amonium format pakon 0,15% asam formik ibagas bah) pakon penyangga B (ACN). Gradienni aima songon on: 0%B bani 0 menit; 0%B. 0 ronsi 15% B bani 0 ronsi 0,1 menit; 15 ronsi 17% B bani 0,1 ronsi 0,5 menit; B bani 17 ronsi 55% bani 0,5 ronsi 14 menit; B bani 55 ronsi 70% bani 14 ronsi 14,5 menit; bani 14.5 das hubani 70 das hubani 100% B bani 18 menit; 100% B bani 18 ronsi 19 menit; 100 ronsi 0% B bani 19 ronsi 19,1 menit; 0% B bani 19,1 ronsi 28 menit (55, 56). Spektrometer massa QE-HF beroperasi ibagas mode ionisasi positif pakon rentang massa m/z (rasio massa/muatan) 50 ronsi 750. Resolusi na iterapkon aima 60.000, pakon target ion kontrol gain (AGC) na dapot aima 3×106, pakon panorang ion maksimal aima 100 milikon. Sumber ionisasi elektrospray na ipanaskon (ESI) beroperasi bani tegangan semprotan 3,5 kV, suhu kapiler 250°C, aliran udara sarung 60 AU (unit sewenang-wenang), pakon aliran udara tambahan 20 AU. 250°C. Lensa S ibahen gabe 60 AU.
Analisis kromatografi anion-MS humbani asam organik na marlabel 13C. Sisa endapan metabolit (55μl) ipareksa mamakei sistem kromatografi ion Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) na ihubungkon hubani spektrometer massa QE-HF (Thermo Fisher Scientific). Singkatni, 5μl ekstrak metabolit isuntikkon hubagas kolom Dionex IonPac AS11-HC na ilengkapi HPLC (2 mm×250 mm, ukuran partikel 4μm, Thermo Fisher Scientific) ibagas mode loop parsial push-in pakon rasio pengisian 1. ) Dionex IonPac AG11-HC mmguard kolom (250 mm, 250 mm 4μm, Thermo Fisher Scientific). Suhu kolom ijaga 30°C, pakon autosampler ibahen 6°C. Pakei ma kartrid kalium hidroksida na ipasirsir pakon bah na deionisasi laho mambahen gradien kalium hidroksida marhiteihon generator eluen. Pemisahan metabolit bani laju aliran 380μl/min, mamakei gradien na i toruh on: 0 ronsi 3 menit, 10 mM KOH; 3 ronsi 12 menit, 10 ronsi 50 mM KOH; 12 ronsi 19 menit, 50 ronsi 100 mM KOH; 19 ronsi 21 menit, 100 mM KOH; 21 ronsi 21,5 menit, 100 ronsi 10 mM KOH. Kolom ai iseimbangkon use i toruh ni 10 mM KOH sadokah 8,5 menit.
Metabolit na ieluasi ipadomu pakon aliran suplemen isopropanol 150μl/min dob kolom dob ai iarahkon hubani spektrometer massa resolusi tinggi na beroperasi ibagas mode ionisasi negatif. MS memantau rentang massa humbani m/z 50 das hubani 750 pakon resolusi 60.000. AGC ibahen gabe 1×106, anjaha panorang ion maksimal ijaga 100 ms. Sumber ESI na ipagara ai ioperasihon bani tegangan semprotan 3,5 kV. Pengaturan sumber ion na legan aima songon na i toruh on: suhu kapiler 275°C; aliran gas sarung, 60 AU; aliran gas tambahan, 20 AU bani 300°C, pakon pengaturan lensa S hubani 60 AU.
Analisis data metabolit na marlabel 13C. Manggunahon perangkat lunak TraceFinder (versi 4.2, Thermo Fisher Scientific) laho menganalisa data rasio isotop. Identitas ni ganup senyawa domma iverifikasi marhiteihon senyawa referensi na boi ihaporsayai janah ipareksa secara independen. Laho mambahen analisis pengayaan isotop, luas kromatogram ion na i ekstrak (XIC) humbani ganup isotop 13C (Mn) i ekstrak humbani [M + H] +, ija n aima nomor karbon ni senyawa target, ipakei laho menganalisa asam amino atap [ MH] + ipakei laho menganalisa anion. Ketepatan massa XIC hurang humbani lima bagian per juta, pakon ketepatan RT 0,05 menit. Analisis pengayaan ibahen marhitei na mangetong rasio ni ganup isotop na tardeteksi hubani jumlah ni ganup isotop ni senyawa na sadalan. Rasio-rasio on ibere sebagai nilai persentase bani ganup isotop, anjaha hasilni ipatugah sebagai pengayaan persentase molar (MPE), songon na dob ipatugah nongkan (42).
Pelet neuron na dob beku ai ihomogenhon ibagas metanol 80% (v/v) na borgoh songon es, iputar, anjaha i inkubasi bani -20°C sadokah 30 menit. Putar ma use sampel ai janah aduk bani +4°C sadokah 30 menit. Sampel ai isentrifugasi bani 21.000 g sadokah 5 menit bani suhu 4°C, dob ai supernatan na ihasilhon ipatumpu janah ikerangkon mamakei konsentrator SpeedVac bani suhu 25°C laho analisis selanjutni. Songon na dob ipatugah i atas, analisis LC-MS ibahen bani asam amino sel na dob ipilih. Manggunahon TraceFinder (versi 4.2, Thermo Fisher Scientific), analisis data ibahen mamakei massa monoisotopik ni ganup senyawa. Normalisasi kuantil data metabolit ibahen mamakei paket perangkat lunak preprocessCore (57).
Persiapan irisan. Tikus ai mintor i bius marhiteihon karbon dioksida dob ai iponggolhon ulu, otakni mintor ipadarat humbani tangkog, anjaha pisou na margetar na igoki es (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Jerman) ipakei laho mamotong ai gabe bagian sagittal 300 ronsi 375 μm gasifikasi karbon COd (25% CO) Ca2 + ACSF na rendah (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM penyangga fosfat natrium, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukosa, 1,0 mM CaCl2 pakon 6,0 mM MgCl2 Sesuaihon hubani pH 4 pakon 30 mM). Pindahi ma irisan otak na dapot ai hu kamar na marisi Ca2 + ACSF na lobih gijang (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM penyangga natrium fosfat, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukosa, 4,0 ml mM CaCl pakon pH 5,5 mM MC) 7.4 pakon 310 ronsi 320 mOsm). Simpan ma irisan ai 20 ronsi 30 menit ase boi ipulihkan paima i rekam.
rekaman. Sada panggung mikroskop na ilengkapi pakon ruang rekaman na totap pakon lensa objektif immersi bah 20x (Scientifica) ipakei bani ganup rekaman. Sel Purkinje na ianggap itanda marhitei (i) ukuran angkula, (ii) ianan anatomi ni otak kecil, pakon (iii) ekspresi gen reporter mtYFP na marneon. Pipet tambalan na martahan ujung 5 ronsi 11 megohms itarik marhiteihon kapiler kaca borosilikat (GB150-10, 0.86 mm×1.5 mm×100 mm, Produk Sains, Hofheim, Jerman) pakon pipet horisontal Instruments (P-10000), Sutter, CA). Haganup rekaman ibahen marhiteihon ELC-03XS npi patch clamp amplifier (npi electronic GmbH, Tam, Jerman), na ikontrol marhiteihon perangkat lunak Signal (versi 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK). Percobaan ai i rekam bani tingkat sampling 12,5 kHz. Sinyal ai isaring marhitei dua filter Bessel short-pass pakon frekuensi cutoff 1,3 pakon 10 kHz. Kapasitas membran pakon pipet ikompensasi marhitei rangkaian kompensasi mamakei penguat. Haganup percobaan ibahen ibagas kontrol kamera Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Jerman), na ikontrol marhiteihon perangkat lunak Hokawo (versi 2.8, Hamamatsu, Gerden, Jerman).
Konfigurasi pakon analisis sel-sel na rutin. Paima manrekam, isi ma pipet ai pakon larutan internal na marisi zat-zat na i toruh on: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM kalium glukonat, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (MM), 5 MM trifosit. (GTP) (Na) pakon 10,0 mM kreatinin fosfat iubah hubani pH 7,25, pakon tekanan osmotik 290 mOsm (sukrosa). Dobkonsi ibahen gogoh 0 pA laho manrobohkon membran, iukur ma potensi membran na istirahat. Ketahanan masukan iukur marhitei na manggunahon arus hiperpolarisasi -40, -30, -20, pakon -10 pA. Ukur ma banggalni respon tegangan pakon pakei ma hukum Ohm laho mangetong resistensi masukan. Aktivitas spontan isuratkon bani penjepit tegangan sadokah 5 menit, anjaha sPSC itanda janah iukur bani Igor Pro (versi 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) mamakei skrip pengenalan semi-otomatis. Kurva IV pakon arus steady-state iukur marhitei na manjepit baterai bani potensi na berbeda (mulai humbani -110 mV) pakon manambah tegangan ibagas langkah 5 mV. Produksi AP iuji marhitei na manggunahon arus depolarisasi. Jepit sel ai bani -70 mV sambil manggunahon pulsa arus depolarisasi. Atur ma ukuran langkah ni ganup unit rekaman secara terpisah (10 ronsi 60 pA). Etong ma frekuensi AP maksimal marhitei na mangitong secara manual lonjakan pulsa na mambahen frekuensi AP na tertinggi. Ambang batas AP ipareksa mamakei turunan paduahon humbani pulsa depolarisasi na parlobei mambahen sada atap lobih AP.
Konfigurasi pakon analisis tambalan na marlubang. Bahen ma rekaman tambalan na marlubang mamakei protokol standar. Pakei ma pipet bebas ATP pakon GTP na lang marisi bahan-bahan na i toruh on: 128 mM glukonat K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EGTA pakon 2 mM MgCl2, dob ai atur ma pH 7,2 (mamakei KOH). ATP pakon GTP ipadaoh humbani larutan intraseluler laho mancegah permeabilitas membran sel na lang terkendali. Pipet tambalan ai iisi pakon larutan internal na marisi amfoterisin (hira-hira 200 ronsi 250μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) laho mandapotkon catatan tambalan na dob ibondut. Amfoterisin ilarutkon bani dimetil sulfoksida (konsentrasi akhir: 0,1 ronsi 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Konsentrasi DMSO na ipakei lang marpangkorhon na signifikan hubani neuron na ipelajari. Bani proses meninju, resistensi saluran (Ra) torus i pantau, anjaha percobaan imulaini dobkonsi amplitudo Ra pakon AP stabil (20-40 menit). Aktivitas spontan iukur bani penjepit tegangan pakon/atap arus sadokah 2 ronsi 5 menit. Analisis data ibahen mamakei Igor Pro (versi 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (versi 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) pakon GraphPad Prism (versi 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Amerika Serikat). Ase boi mangindahi AP na spontan, ipakei ma plug-in NeuroMatic v3.0c ni IgorPro. Otomatis mangidentifikasi AP mamakei ambang batas na dob ibere, na iubah secara pribadi bani ganup catatan. Manggunahon interval spike, tontuhon ma frekuensi spike pakon frekuensi spike instan maksimal pakon frekuensi spike rata-rata.
Isolasi PN. Marhitei na menyesuaihon hubani protokol na dob iterbitkon sebelumni, PNs imurnihkon humbani serebelum tikus bani tahap na dob itontuhon (58). Singkatni, serebelum i bedah janah i giling bani media disosiasi na borgoh songon es [tanpa HBSS Ca2+ pakon Mg2+, itambahi 20 mM glukosa, penisilin (50 U/ml) pakon streptomisin (0,05 mg/ ml)], dob ai icerna ma media ai bani media papa [HBSS, itambahi HBSS-stein pakon Mg2+ (1 mg / ml), papain (16 U / ml) pakon deoxyribonuclease I (DNase I; 0.1 mg/ml)] Perbati 30 menit bani suhu 30°C. Parlobei, cuci ma jaringan ai bani media HBSS na marisi lendir tolor (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) pakon DNase (0,1 mg/ml) bani suhu kamar laho mancegah pencernaan enzimatik, dob ai bani media HBSS na marisi 20 mM glukosa Giling ma lembut bani HBSS peillinic, peillinic (0,0 mg/ml), strep (0.05 mg/ml) pakon DNase (0.1 mg/ml) paluahkon sel tunggal. Suspensi sel na ihasilhon isaring marhiteihon saringan sel 70μm, dob ai sel-sel ai ipelet marhitei sentrifugasi (1110 rpm, 5 menit, 4°C) pakon isuspensihon use bani media penyortiran [HBSS, itambahi glukosa 20 mM, 20% janin sapi ) Serum, pelinik (50/50) pakon strep (0.05 mg/ml)]; mangevaluasi daya tahan sel marhiteihon propidium iodide pakon menyesuaihon kepadatan sel gabe 1×106 ronsi 2×106 sel/ml. Paima flow cytometry, suspensi ai isaring marhiteihon saringan sel 50 μm.
Sitometer aliran. Penyortiran sel ibahen bani suhu 4°C mamakei mesin FACSAria III (BD Biosciences) pakon perangkat lunak FACSDiva (BD Biosciences, versi 8.0.1). Suspensi sel ipilih mamakei nozzle 100 μm i toruh ni tekanan 20 psi bani kecepatan ~2800 peristiwa/detik. Halani kriteria gating tradisional (ukuran sel, diskriminasi bimodal, pakon karakteristik hamburan) lang boi memastikan isolasi PN na sintong humbani jenis sel na legan, strategi gating iatur berdasarhon perbandingan langsung intensitas YFP pakon autofluoresensi bani mitoYFP+ ​​pakon kontrol mitoYFP − Tikus. YFP i tereksitasi marhitei na manradiasi sampel marhitei garis laser 488 nm, anjaha sinyal ai ideteksi mamakei filter band pass 530/30 nm. Bani tikus mitoYFP+, kekuatan relatif gen reporter Rosa26-mitoYFP ipakei homa laho mambedahon badan saraf pakon fragmen akson. 7-AAD i tereksitasi marhitei laser kuning 561 nm pakon ideteksi marhitei filter bandpass 675/20 nm laho mengecualihon sel na matei. Ase boi mamisahkon astrosit bani panorang na sarupa, suspensi sel iwarnai marhitei ACSA-2-APC, dob ai sampel ai iradiasi marhitei garis laser 640 nm, pakon filter bandpass 660/20 nm ipakei laho mangidah sinyal.
Sel na dob ipatumpu i pelet marhitei sentrifugasi (1110 rpm, 5 menit, 4°C) pakon isimpan bani -80°C ronsi ipakei. Tikus Mfn2cKO pakon anakni iklasipikasihon bani ari na sarupa laho meminimalhon variabilitas prosedur. Penyajian pakon analisis data FACS ibahen mamakei perangkat lunak FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
Songon na dob isobut i atas (59), PCR real-time ipakei laho mangisolasi DNA humbani neuron na ipilih laho mangukur mtDNA selanjutni. Linearitas pakon sensitivitas ambang batas bani mungkahni iuji marhitei na manjalankon qPCR bani bilangan sel na berbeda. Singkatni, patumpu ma 300 PN bani penyangga lisis na terdiri humbani 50 mM tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20 pakon proteinase K (200 ng/ml) dob ai inkubasi bani 55°C 120 menit. Sel-sel ai i inkubasi use bani suhu 95°C sadokah 10 menit laho memastikan inaktivasi lengkap proteinase K. Manggunahon probe TaqMan (Thermo Fisher) na khusus hubani mt-Nd1, mtDNA iukur marhitei PCR semi-kuantitatif bani sistem 7900HT Real-Time PCR (Thermo Fisher Fiscients). Sains, nomor katalog Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, nomor katalog AIVI3E8) pakon 18S (Thermo Fisher Scientific, nomor katalog Hs99999901_s1) gen.
Persiapan sampel proteom. Marhitei na pamanaskon larutan ai bani suhu 95°C sadokah 10 menit pakon sonikasi, bani penyangga lisis [6 M guanidin klorida, 10 mM tris(2-karboksietil) fosfin hidroklorida, 10 mM kloroasetamida pakon 100 mM tris-Lise beku bani pelet neuron HC]. Bani Bioruptor (Diagenode) sadokah 10 menit (30 detik pulsa / 30 detik masa jeda). Sampel ai iencerkan 1:10 ibagas 20 mM tris-HCl (pH 8,0), icampur pakon 300 ng trypsin gold (Promega), dob ai i inkubasi saborngin bani suhu 37°C ase boi lengkap pencernaan. Bani ari paduahon, sampel ai isentrifugasi bani 20.000 g sadokah 20 menit. Supernatan ai iencerkan pakon asam formik 0,1%, dob ai larutan ai ipadaoh garam pakon StageTips na ibahen sandiri. Sampel ai ikerangkon bani alat SpeedVac (konsentrator Eppendorf tambah 5305) bani suhu 45°C, dob ai peptida ai isuspensihon bani asam formik 0,1%. Haganup sampel ipasirsir secara serentak oleh sada halak. Laho menganalisa sampel astrosit, 4 μg peptida na lang margaram ibere label pakon tanda massa tandem (TMT10plex, nomor katalog 90110, Thermo Fisher Scientific) pakon rasio reagen peptida hubani TMT 1:20. Bani pelabelan TMT, 0,8 mg reagen TMT isuspensihon use bani 70 μl ACN anhidrat, anjaha peptida na dob kering ikonstitusi use gabe 9 μl 0,1 M TEAB (triethylammonium bikarbonat), na itambahkon 7 μl reagen TMT bani ACN. Konsentrasi ai 43.75%. Dob 60 menit inkubasi, reaksi ai ipadaoh marhitei 2 μl 5% hidroksilamin. Peptida na marlabel ipatumpu, ikerangkon, isuspensihon use ibagas 200μl asam formik (FA) 0,1%, ibagi dua, dob ai ipadaoh garam mamakei StageTips na ibahen sandiri. Manggunahon UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph (UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph), sada humbani dua bagian ai ifraksihon bani kolom kromatografi Acquity 1mm x 150mm na igoki partikel C18 130Å1.7μm (Waters, katalog No SKU: 196566). Thermo Fisher Scientific). Pisahkon peptida bani laju aliran 30μl/min, pisahkon humbani 1% ronsi 50% penyangga B sadokah 85 menit marhiteihon gradien bertahap 96 menit, humbani 50% ronsi 95% penyangga B sadokah 3 menit, dob ai 8 menit bani 95 % Penyangga B; Penyangga A aima 5% ACN pakon 10 mM amonium bikarbonat (ABC), pakon penyangga B aima 80% ACN pakon 10 mM ABC. Patumpu ma pecahan tiap 3 menit anjaha padomu ma ai gabe dua kelompok (1 + 17, 2 + 18, pnl.) dob ai keringkon ma ai ibagas sentrifugal vakum.
Analisis LC-MS/MS. Bani spektrometri massa, peptida (nomor r119.aq) ipisahon bani kolom analitik PicoFrit 25 cm, 75 μm diameter bagian bagas (lensa objektif baru, nomor bagian PF7508250) na ilengkapi pakon 1,9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQD medium (Maischr, Maisch, UAS. 1200 (Thermo Fisher Scientific, Jerman). Kolom ai ipertahankon bani 50°C. Penyangga A pakon B aima 0,1% asam formik ibagas bah pakon 0,1% asam formik ibagas 80% ACN, masing-masing. Peptida ipisahon humbani 6% ronsi 31% penyangga B sadokah 65 menit pakon humbani 31% ronsi 50% penyangga B sadokah 5 menit marhiteihon gradien 200 nl/min. Peptida na ieluasi ipareksa bani spektrometer massa Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). Pangukuran m/z prekursor peptida ibahen marhitei resolusi 120.000 i kisaran 350 ronsi 1500 m/z. Manggunahon 27% energi tabrakan na dob inormalhon, prekursor na paling gogoh pakon keadaan muatan 2 ronsi 6 ipilih untuk pembelahan dissosiasi perangkap C (HCD) energi tinggi. Panorang siklus ibahen gabe 1 s. Nilai m/z ni fragmen peptida iukur bani perangkap ion mamakei target AGC na etek 5×104 pakon panorang suntikan maksimal 86 ms. Dobkonsi fragmentasi, prekursor ai ibahen bani daftar pengecualian dinamis sadokah 45 s. Peptida na marlabel TMT ipisahkon bani kolom Acclaim PepMap 50 cm, 75 μm (Thermo Fisher Scientific, nomor katalog 164942), pakon spektrum migrasi ipareksa bani spektrometer massa Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) na ilengkapi pakon ion-ion simetris medan tinggi (IMS) peralatan (Thermo Fisher Scientific) beroperasi bani dua tegangan kompensasi −50 pakon −70 V. MS3 na ipilih berdasarhon prekursor sinkronisasi ipakei bani pangukuran sinyal ion laporan TMT. Pemisahan peptida ibahen bani EASY-nLC 1200, mamakei elusi gradien linier 90%, pakon konsentrasi penyangga 6% ronsi 31%; penyangga A aima 0,1% FA, pakon penyangga B aima 0,1% FA pakon 80% ACN. Kolom analisis ioperasihon bani suhu 50°C. Pakei ma FreeStyle (versi 1.6, Thermo Fisher Scientific) laho mambagi file asli domu hubani tegangan kompensasi FAIMS.
Identifikasi pakon pangukuran protein. Manggunahon mesin pencari Andromeda na dob ipadomu, data asli ipareksa mamakei MaxQuant versi 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Leganni urutan Cre rekombinase pakon YFP na dapot humbani Aequorea victoria, spektrum fragmen peptida ipindahi bani urutan kanonik pakon urutan isoform proteom referensi tikus (Proteome ID UP000000589, i-download humbani UniProt bani bulan Mei 2017). Oksidasi metionin pakon asetilasi N-terminal protein ibahen gabe modifikasi variabel; metilasi karbamoil sistein ibahen gabe modifikasi na totap. Parameter pencernaan ibahen gabe “spesifisitas” pakon “trypsin/P”. Jumlah minimum peptida pakon peptida silet na ipakei laho mangindahi protein aima 1; jumlah minimum peptida unik aima 0. Bani kondisi pencocokan peta peptida, tingkat identifikasi protein aima 0,01. Pilihan “Peptida paduahon” domma iaktifkon. Pakei ma pilihan “cocok antara lari” laho papindahkon identifikasi na berhasil antara file asli na berbeda. Pakei ma LFQ rasio minimum bilangan 1 untuk kuantifikasi bebas label (LFQ) (60). Intensitas LFQ isaring bani saotikni dua nilai na sah bani saotikni sada kelompok genotipe bani ganup titik panorang, anjaha iekstrapolasi humbani distribusi normal pakon lebar. 0.3 pakon turun 1.8. Manggunahon platform komputasi Perseus (https://maxquant.net/perseus/) pakon R (https://r-project.org/) laho menganalisa hasil LFQ. Uji t moderat dua arah humbani paket perangkat lunak limma ipakei laho analisis ekspresi diferensial (61). Analisis data eksploratif ibahen mamakei ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally pakon pheatmap. Data proteomik berbasis TMT ipareksa mamakei MaxQuant versi 1.6.10.43. Mangindahi data proteomik mentah humbani database proteomik ni jolma UniProt, na i-download bani bulan September 2018. Analisis ai termasuk faktor koreksi kemurnian isotop na ipasirsir pabrik. Manggunahon limma i R untuk analisis ekspresi diferensial. Data asli, hasil pencarian database, pakon alur kerja pakon hasil analisis data haganupan isimpan bani aliansi ProteomeXchange marhitei repositori mitra PRIDE pakon pengidentifikasi set data PXD019690.
Anotasi fungsional mambahen lambin bayak analisis ai. Alat Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) ipakei laho manontuhon kekayaan istilah anotasi fungsional humbani data set bani 8 minggu (Gambar 1). Singkatni, daftar protein kuantitatif na dapot humbani analisis data LC-MS/MS (spektrometri massa tandem) ipakei pakon kriteria filter na i toruh on: Mus musculus ipilih sebagai spesies pakon latar belakang, pakon kategori na pataridahkon nilai P na iubah Benjamini untuk pengayaan 0,05 atap itoruhni ianggap signifikan. Bani grafik on, lima kategori kelebihan na parlobei bani ganup kluster berdasarhon nilai P na dob iubah ipatuduh. Manggunahon t-test na marbagei, mamakei program dorongan linier dua tahap Benjamini, Krieger, pakon Yekutieli (Q = 5%), analisis ekspresi protein pardalanan panorang ibahen bani kandidat na ponting na itandahon bani ganup kategori, anjaha ganup baris ipareksa secara terpisah. Lang pala porlu mangadopkon SD na konsisten.
Ase boi ibandingkon hasil penelitian on pakon database na dob iterbitkon pakon mambahen diagram Venn bani Gambar 1, ipadomu hanami ma daftar protein kuantitatif pakon anotasi MitoCarta 2.0 (24). Pakei ma alat online Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) laho mambahen diagram ai.
Anggo sihol mambotoh hatorangan na lambin bagas pasal prosedur statistik na ipakei bani analisis proteomik, tonton ma bagian Bahan pakon Metode na sadalan. Bani haganup percobaan na legan, hatorangan na rinci boi idapot bani legenda na sadalan. Anggo lang ipatugah na legan, haganup data ipatugah sebagai rata-rata ± SEM, anjaha haganup analisis statistik ibahen mamakei perangkat lunak GraphPad Prism 8.1.2.
Anggo dong bahan tambahan bani artikel on, boi do ididah nasiam http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
On ma sada artikel akses terbuka na ibagihon mangihutkon syarat-syarat Lisensi Atribusi-Non-Komersial Creative Commons, na mangijinkon penggunaan, distribusi pakon reproduksi bani media aha pe, asal ma penggunaan akhir lang untuk keuntungan komersial pakon premisni aima anggo karya aslini domma sintong. Referensi.
Catatan: Hanami pitah mangindo ase nassiam mambere alamat email nassiam ase halak na isaranhon nassiam hu halaman on mambotoh anggo nassiam sihol mangidah email ai janah lang spam. Lang ra hanami manangkap alamat email.
Sungkun-sungkun on ipakei laho manguji atap na ham do pengunjung pakon mancegah pengiriman spam otomatis.
Humbani E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Analisis proteomik neuron na lang marfungsi pataridahkon bahwa program metabolisme iaktifkon laho manlawan neurodegenerasi.
Humbani E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Analisis proteomik neuron na lang marfungsi pataridahkon bahwa program metabolisme iaktifkon laho manlawan neurodegenerasi.
©2020 Asosiasi Amerika untuk Kemajuan Sains. haganup hak ipartahankon. AAAS aima mitra ni HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef pakon COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.