Penyortiran protein bani jalur sekresi porlu tumang laho manramotkon kompartementalisasi sel pakon homeostasis. Leganni penyortiran na imediasi cangkang, peran ni lipid bani penyortiran kinesin bani proses transportasi sekresi aima sada sungkun-sungkun dasar na domma dokah na lape ibalosi. Ijon, hanami mambahen pencitraan real-time resolusi tinggi multiwarna simultan 3D laho mambuktihon in vivo bahwa protein na baru isintesis glikosilfosfatidilinositol-imobilisasi pakon bagian lipid seramida na sangat ganjang ikelompokkon janah iklasipikasihon gabe endoplasma khusus Net exit site, na berbeda humbani na ipakei protein transmembran. Leganni ai, ipatuduh hanami do anggo ganjang ni rantai ni seramida bani membran retikulum endoplasma sangat porlu bani selektivitas penyortiran on. Penelitian nami mambere bukti in vivo langsung na parlobei laho mangklasifikasihon muatan protein berdasarhon ganjang rantai lipid hubani situs ekspor selektif bani jalur sekresi.
Bani sel eukariotik, protein na isintesis bani retikulum endoplasma (ER) dob ai ipilih sanggah transportasi marhitei jalur sekretoris laho itongos hu tujuan seluler na sosok (1). Leganni penyortiran na imediasi lapisan, domma dokah iperkirahon bahwa lipid tertentu boi do homa berfungsi sebagai titik kaluar selektif marhitei na mengkelompokkon sidea hubani domain membran tertentu hubani protein tertentu (2-5). Tapi, hurang ope bukti in vivo na langsung laho mambuktihon mekanisme berbasis lipid na mungkin on. Ase boi pasaloseihon masalah dasar on, iparlajari hanami do bani ragi sonaha glikosilfosfatidilinositol (GPI) protein berlabuh (GPI-APs) iekspor secara berbeda humbani ER. GPI-APs aima bagei-bagei ni protein permukaan sel na mardomu hubani lipid ( 6, 7). GPI-AP aima sada protein na isekresihon na melekat bani selebaran luar membran plasma marhiteihon bagian glikolipid (jangkar GPI). Ijalo sidea do jangkar GPI sebagai modifikasi pasca-translasi konservatif bani lumen ER (8). Dobkonsi ipasang, GPI-AP mamolus alat Golgi (5, 9) hun ER hu membran plasma. Hadirion ni jangkar GPI mambahen GPI-AP iangkut secara terpisah humbani protein na isekresihon transmembran (termasuk protein membran plasma na legan) i sepanjang jalur sekresi (5, 9, 10). Bani sel ragi, GPI-APs ipisahon humbani protein na legan na isekresihon bani retikulum endoplasma, dob ai i bungkus gabe vesikel na unik na ibaluti kompleks protein lapisan II (COPII) (6, 7). Penentu proses klasifikasi on bani proses ekspor ER lang jelas, tapi iperkirahon bahwa mekanisme on mungkin mamorluhon lipid, terutama remodeling struktural bagian lipid jangkar GPI (5, 8). Bani ragi, remodeling lipid GPI ipungkah mintor dobkonsi GPI menempel, anjaha bani buei kasus, ai mambahen ceramide mengikat hubani asam lemak jenuh rantai panjang 26-karbon (C26:0) (11, 12). C26 ceramide aima ceramide utama na iproduksi sel ragi sadokah on. On isintesis i ER anjaha bahatan do ai i ekspor hu aparat Golgi marhiteihon vesikel COPII (13). Ekspor ER GPI-AP secara khusus mamorluhon sintesis seramida na berkelanjutan (14, 15), anjaha bani giliranni, konversi seramida gabe inositol fosfat seramida (IPC) bani aparat Golgi bergantung hubani sintesis jangkar GPI (16). Studi biofisika pakon membran buatan domma patuduhkon bahwa keramida rantai asil na ganjang tumang boi mardomu gabe domain na teratur pakon sifat fisik na unik (17, 18). Data on mangarahkon hubani hipotesis bahwa C26 ceramide pakon GPI-AP pakon C26 ceramide mamakei sifat fisik ni sidea laho mardomu gabe daerah na taratur atap daerah bani lingkungan lipid membran ER na relatif kacau. On tarlobih terdiri humbani gliserolipid na pondok pakon na lang jenuh (C16:1 pakon C18:1) (19, 20). Daerah-daerah on secara selektif fokus hubani situs keluar ER tertentu (ERES), ija seramida pakon GPI-AP berbasis seramida boi bersama-sama iangkut hu Golgi bani vesikel COPII na khusus na sarupa (5).
Bani penelitian on, domma iuji hanami secara langsung mekanisme berbasis lipid on mamakei mikroskop pencitraan real-time konfokal super-resolusi (SCLIM), aima sada teknik mikroskop canggih na boi secara serentak mangamati protein na marlabel fluoresen Gambar tolu warna pakon tolu dimensi (3D) memiliki resolusi na sangat tinggi pakon kecepatan na sangat tinggi bani sel na manggoluh (22, 22).
Parlobei igunahon hanami teknologi SCLIM laho lobih mendefinisihon sonaha GPI-AP normal pakon kelompok ceramide C26 isaring humbani protein na isekresihon transmembran dobkonsi manadingkon ER i S. cerevisiae. Laho mamareksa klasifikasi ER, ipakei hanami ma sistem genetik na boi secara langsung mangidah kargo na baru isintesis masuk hu ERES in vivo (7, 23). Songon muatan, ipilih hanami C26 ceramide-based GPI-AP Gas1 na marlabel protein fluoresen hijau (GFP) pakon protein sekresi transmembran Mid2 na marlabel protein fluoresen inframerah dekat (iRFP), na dua ai martujuan hubani membran plasma (24-26). Bani mutan na sensitif bani suhu sec31-1, dua muatan on iekspresihon i toruh ni promotor na boi i induksi galaktosa pakon penanda ERES na konstitutif. Bani suhu na ekstrim (37°C), halani mutasi sec31-1 mambahen fungsi komponen lapisan COPII Sec31 laho menghambat perkecambahan COPII pakon ekspor ER, kargo na baru isintesis martumpu i ER (23). Dobkonsi borgoh das hubani suhu na rendah (24°C), sel mutan sec31-1 malum humbani daerah sekresi, pakon muatan sintetis na baru na dob ipatumpu mulai i ekspor hun ER. Visualisasi CLIM pataridahkon bahwa sebagian besar Gas1-GFP pakon Mid2-iRFP na baru isintesis totap do martumpu i ER sel mutan sec31-1 dob inkubasi bani suhu 37°C dob ai ipaluah bani suhu 24°C sadokah 5 menit (Gambar 1). Halani Mid2-iRFP tersebar bani ganup membran ER, pakon Gas1-GFP terkonsentrasi pakon martumpu bani daerah membran ER na lang berkelanjutan, distribusi ni sidea sama sekali berbeda (Gambar 1, A ronsi C pakon Film S1). Leganni ai, songon na taridah bani Gambar 1D, kluster Gas1-GFP lang dong Mid2-iRFP. Hasil on pataridahkon bahwa GPI-AP pakon protein transmembran domma ipisahkon hubani daerah membran ER na berbeda humbani mungkahni. Gugus Gas1-GFP berdekatan pakon ERES tertentu na ilabelhon protein lapisan COPII mCherry Sec13 (Gambar 1, E pakon F, pakon film S1) (23).
sel sec31-1 mengekspresihon sekresi na ihasilhon galaktosa, rantai asil na ganjang (C26) seramida GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, hijau) pakon protein transmembran Mid2-iRFP (TMP, birong) pakon pelabelan ERES Konstruktif on Sec13-mCherry (E) i inkubasi bani 30 ° C menit, ipindahi hu 24°C, anjaha igambarhon SCLIM 5 menit dob ​​ai. (A das hubani C) pataridahkon gambar 2D na ipadomu atap tunggal na mewakili sada pesawat (A), gambar proyeksi 2D humbani 10 z-section (B) atap gambar belahan sel 3D humbani kargo pakon penanda ERES (C). Skala bar 1μm (A pakon B). Satuan skala aima 0.551μm (C). Gas1-GFP tardeteksi bani daerah atap kluster ER na terpisah, sementara Mid2-iRFP tardeteksi janah ibagihon bani ganup membran ER (C). (D) Grafik pataridahkon intensitas fluoresensi relatif Gas1-GFP pakon Mid2-iRFP bani kluster Gas1-GFP i sepanjang garis panah putih (hambirang). AU, unit na sewenang-wenang. (E pakon F) manggambarhon gambar 3D na padomuhon barang pakon tanda ERES. Gugus Gas1-GFP tardeteksi dohorhon ERES na khusus. Satuan skala aima 0.551μm. (F) Panah padat putih menandai kluster Gas1-GFP na berkaitan pakon ERES. Panel partongah pakon siamun pataridahkon gambar 3D na dob ipadomu pakon panonggoran na iputar humbani kluster Gas1-GFP na ipilih.
Hubungan spasial na dohor antara kluster Gas1-GFP pakon ERES na khusus pataridahkon bahwa Gas1-GFP boi masuk hu ERES selektif, na berbeda humbani selektivitas na ipakei Mid2-iRFP laho manadingkon ER. Laho mangatasi kemungkinan on, iukur hanami ma rasio ERES pitah bani sada atap dua barang (Gambar 2, A das hubani C). Ijumpahi hanami do bahatni ERES (70%) pitah marisi sada jenis muatan. Gambar i toruh Gambar 2C pataridahkon dua contoh khas ERES na pitah Gas1-GFP (Gambar 1) atap pitah Mid2-iRFP (Gambar 2). Sebalikni, hira-hira 20% ERES marisi dua muatan na tumpang tindih bani sada daerah. Ijumpahi do piga-piga ERES (10%) marisi dua jenis muatan, tapi sidea terisolasi bani daerah na jelas berbeda. Halani ai, analisis statistik on pataridahkon dob ER i ekspor, GPI-AP Gas1-GFP pakon muatan transmembran Mid2-iRFP ibagi gabe ERES na berbeda (Gambar 2D). Efisiensi penyortiran on sangat konsisten pakon analisis biokimia sebelumni (6) pakon penentuan morfologis (7). Boi do homa ididah hita parlahou ni muatan na ikarantina masuk hu ERES (Gambar 2E pakon Film S2). Gambar 2E pataridahkon pitah porsi na etek do Gas1-GFP (panel 3) atap Mid2-iRFP (panel 4) masuk hu ERES humbani sada sisi janah tarbatas bani sada ianan na terpisah. Panel 5 Gambar 2E pataridahkon bahwa Gas1-GFP pakon Mid2-iRFP sipata jumpah bani ERES na sarupa, tapi sidea masuk humbani sisi na berbeda janah terkonsentrasi bani daerah na terpisah na mungkin mewakili vesikel COPII na berbeda. Ikonfirmasi hanami do homa bahwa pemisahan pakon klasifikasi na iperhatihon C26 ceramide-based GPI-AP Gas1 sebagai ERES selektif aima spesifik halani kargo sekresi transmembran na legan, protein membran plasma na martanda GFP Axl2 (27 ), pataridahkon perilaku na sarupa pakon Mid2-iRFP. (Gambar S1 pakon Film S3). Axl2-GFP na baru isintesis ibagihon marhiteihon membran ER songon Mid2-iRFP (Gambar S1, A pakon B), pakon bersamaan pakon Mid2-iRFP bani bueinan ERES (Gambar S1, B das hubani D). Panel 1 pakon 2 Gambar 1. S1C pataridahkon dua contoh khas ERES ija dua muatan transmembran tumpang tindih. Bani kasus-kasus on, haduasi barang masuk hu ERES rap (Gambar S1E, Panel 3 pakon Film S3).
Sel sec31-1 na mengekspresihon sekresi induksi galaktosa, Gas1-GFP (GPI-AP, hijau) pakon Mid2-iRFP (TMP, birong) pakon ERES konstitutif na marlabel Sec13-mCherry (ERES, magenta) ibahen bani 37 Dob i inkubasi 30 menit bani °C 24 °C, ipaluah hu gambar, pakon ion blok pakon SCLIM dob 20 menit. (A das hubani C) Gambar proyeksi 2D na mewakili (A; skala bar, 1μm) atap gambar belahan sel 3D (B pakon C; unit skala, 0,456μm) humbani muatan pakon 10 z-section na itandai ERES. Panel toruh i (B) pakon panel i (C) pataridahkon gambar na dob iproses laho pataridahkon pitah barang-barang na adong bani ERES (magenta) [Gas1-GFP (abu-abu) pakon Mid2-iRFP (biru muda)]. (C) Panah terbuka: ERES pitah mamboan sada muatan (1 ronsi 4). Panah abu-abu: ERES marisi muatan na ipisahkan (5). Panah padat putih: ERES na marisi muatan na berlokasi bersama. I toruh: ERES tunggal na ipilih pitah marisi Gas1-GFP (1) atap Mid2-iRFP (2). Bar skala, 100 nm. (D) Kuantifikasi fotomikrograf na ipatugah bani (C). Persentase rata-rata ERES na pitah marisi sada muatan (Gas1-GFP atap Mid2-iRFP), muatan na terpisah pakon muatan na tumpang tindih. Bani tolu percobaan independen, n=432 bani 54 sel. Bilah kesalahan = SD. Uji t dua ekor na lang marpasangan. *** P = 0.0002. (E) Gambar 3D ERES na ipilih humbani kargo na ikarantina na itandai pakon (C). Gas1-GFP (hijau) (3) atap Mid2-iRFP (biru) (4) masuk hu ERES (magenta) humbani sada sisi janah ibatasi bani sada ianan na etek ibagas ERES. Sipata, haduasi jenis muatan masuk hu ERES na sarupa (5) humbani sisi na sarupa janah terbatas bani sada ianan na terisolasi i bagas ERES. Bar skala, 100 nm.
Dob ai, iuji hanami ma sada hipotesis bahwa keramida rantai asil na ganjang (C26) na adong bani membran ER mendorong pengelompokan pakon penyortiran khusus Gas1 gabe ERES selektif. Bani tujuan on, ipakei hanami do strain ragi na dob imodifikasi GhLag1, ija dua sintase seramida endogen Lag1 pakon Lac1 igantihkon GhLag1 (homolog Lag1 ni kapas), na mambahen strain ragi na marmembran sel strain Ceramide na lobih pondok marimbang tipe liar (Gambar 3A) (28). Analisis spektrometri massa (MS) pataridahkon bahwa bani strain tipe liar, 95% humbani total seramida aima rantai seramida na ganjang tumang (C26), sementara bani GhLag1, 85% humbani seramida ai ganjang tumang (C18 pakon C16). ), pitah 2% do hansa seramida na ganjang tumang (C26) rantai seramida. Hassi pe C18 pakon C16 ceramides aima ceramides utama na tardeteksi bani membran GhLag1 sadokah on, analisis MS pe memastikan bahwa jangkar GPI Gas1-GFP na iekspresihon bani strain GhLag1 marisi C26 ceramide, na sebanding pakon lipid tipe liar. Kualitasni dos do (Gbr. 3A) (26). Halani ai, artini enzim remodeling seramida Cwh43 sangat selektif bani seramida C26, songon na taridah bani Gambar 26, ia lebih memilih memasukkon jangkar GPI humbani sejumlah kecil seramida C26 bani galur GhLag1. S2 (29). Hassi pe sonai, membran sel GhLag1 pitah marisi C18-C16 ceramide, sementara Gas1-GFP totap do C26 ceramide. Fakta on mambahen strain on gabe alat na ideal laho secara khusus pasaloseihon masalah ganjang ni rantai asil membran seramida i ER. Peran hipotetis ni kelas pakon penyortiran. Dob ai, parlobei ma ipelajari hanami kemampuan C26 Gas1-GFP laho martumpu ibagas kluster i GhLag1 pakon alel mutan na sensitif bani suhu sec31-1 marhitei mikroskop fluoresensi konvensional, ija pitah rantai na ganjang (C18-C16) do na adong bani membran ER Ceramide (Gbr. 3). Iidah hanami bahwa bani sec31-1, sebagian besar Gas1-GFP terkonsentrasi ibagas kluster, sementara Gas1-GFP bani sec31-1 GhLag1 dengan membran ER ceramide panjang (C18-C16) panjang terutama tidak terkonsentrasi dan tersebar dalam In seluruh membran ER. Ase tepat, halani C26 ceramide-based clustering dohor do hubunganna hubani ERES na khusus (Gambar 1), selanjutni ipareksa hanami atap proses on boi do homa melibatkon fungsi mekanisme protein ekspor ER. GPI-AP mamakei sistem COPII khusus untuk ekspor ER, na secara aktif iatur marhiteihon remodeling struktural Ted1 bani bagian glikan jangkar GPI (30, 31). GPI-glikan rekombinan ai dob ai itandai kompleks reseptor kargo transmembran p24, na bani giliranni secara selektif merekrut Lst1, na gabe isoform spesifik humbani subunit pengikat kargo COPII utama Sec24, na mambahen COPII na bayak bani GPI-AP Vesikel porlu (31-33). Halani ai, hanami mambahen mutan ganda na padomuhon penghapusan protein tunggal on (komponen kompleks p24 Emp24, enzim remodeling GPI-glikan Ted1 pakon subunit COPII spesifik Lst1) pakon galur mutan sec31-1, pakon mamparlajari sidea Ai boi do mambahen Gas1-luster GFP (Gambar 3). Iidah hanami bahwa bani sec31-1emp24Δ pakon sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP terutama lang martumpu pakon tersebar bani ganup membran ER, songon na dob ididah hinan bani sec31-1 GhLag1, sementara bani sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP Songon sec31-1-1. Hasil on pataridahkon bahwa selain adong C26 ceramide bani membran ER, pengelompokan Gas1-GFP porlu do homa mengikat hubani kompleks p24, janah lang porlu perekrutan Lst1 na khusus. Dob ai, ipareksa hanami ma kemungkinan bahwa ganjang ni rantai ceramide bani membran ER boi mangatur pengikatan Gas1-GFP hubani p24. Tapi, jumpah hanami do anggo kehadiran C18-C16 ceramide bani membran lang berpengaruh hubani GPI-glikan na irekonstruksi kompleks p24 (Gambar S3 pakon S4, A pakon B) atap mengikat hubani GPI-AP pakon mengekspor GPI-AP. tarbahen. Rekrut COPII subtipe Lst1 (Gambar S4C). Halani ai, C26 ceramide-dependent clustering lang mamorluhon interaksi protein pakon mekanisme protein ekspor ER na berbeda, tapi mendukung mekanisme penyortiran alternatif na idorong oleh panjang lipid. Dob ai, hanami menganalisa atap na ganjang ni rantai asil seramida bani membran ER ai ponting do bani klasifikasi Gas1-GFP na efektif sebagai ERES selektif. Halani Gas1 bani strain GhLag1 pakon ceramide rantai pondok manadingkon ER pakon masuk hu membran plasma (Gambar S5), porsaya do hanami anggo penyortiran ai idorong ganjang ni rantai asil ceramide, Gas1 bani strain GhLag1 boi iarahkon janah ilintasi. Barang ERES na marmembran na sarupa.
(A) Membran sel GhLag1 terutama marisi ceramida C18-C16 na pondok, sementara jangkar GPI Gas1-GFP totap do memiliki C26 IPC na sarupa pakon sel tipe liar. I atas: analisis ganjang rantai asil seramida bani membran sel tipe liar (Wt) pakon strain GhLag1p marhitei spektrometri massa (MS). Data ai manggambarhon persentase humbani ganup seramida. Rata-rata humbani tolu percobaan independen. Bilah kesalahan = SD. Uji t dua ekor na lang marpasangan. **** P ＜0.0001. Panel toruh: Analisis MS ganjang ni rantai asil IPC na adong bani jangkar GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) na iekspresihon bani strain tipe liar pakon GhLag1p. Data ai manggambarhon persentase humbani ganup sinyal IPC. Rata-rata humbani lima percobaan independen. Bilah kesalahan = SD. Uji t dua ekor na lang marpasangan. ns, lang ponting. P = 0.9134. (B) Mikrograf fluoresensi sel sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ pakon sec31-1lst1Δ na mengekspresihon Gas1-GFP na ihasilhon galaktosa iinkubasi bani suhu 37°C sadokah 30 menit janah ibahen rutinitas fluoresensi mikroskop dob 24°C. Panah putih: ER Gas1-GFP cluster. Panah terbuka: Gas1-GFP na lang martumpu ibagihon bani ganup membran ER, pataridahkon pewarnaan cincin inti na khas ER. Bar skala, 5μm. (C) Ukuran fotomikrograf na ipatugah bani (B). Rata-rata persentase sel na marstruktur Gas1-GFP na martitik. Bani tolu percobaan independen, n≥300 sel. Bilah kesalahan = SD. Uji t dua ekor na lang marpasangan. **** P ＜0.0001.
Ase boi secara langsung pasaloseihon masalah on, ibahen hanami ma visualisasi SCLIM Gas1-GFP pakon Mid2-iRFP i GhLag1 pakon alel mutan na sensitif bani suhu sec31-1 (Gambar 4 pakon Film S4). Dob ER itahan bani 37°C dob ai ipaluah bani 24°C, sebagian besar Gas1-GFP na baru isintesis lang martumpu janah tersebar bani ganup membran ER, songon na ididah marhitei mikroskop konvensional (Gambar 4, A pakon B ). Leganni ai, buei do persentase ERES (67%) na mencakup dua jenis kargo na bersama-sama marianan ijai (Gambar 4D). Panel 1 pakon 2 Gambar 4C pataridahkon dua contoh khas ERES na tumpang tindih Gas1-GFP pakon Mid2-GFP. Leganni ai, haduasi barang ai irekrut hu ERES na sarupa (Gambar 4E, panel 3 pakon film S4). Halani ai, hasil nami pataridahkon bahwa ganjang ni rantai asil seramida bani membran ER aima penentu na ponting bani agregasi pakon klasifikasi protein ER.
Sel Sec31-1 GhLag1 na mengekspresihon sekresi na ibahen galaktosa, Gas1-GFP (GPI-AP, hijau) pakon Mid2-iRFP (TMP, birong) pakon Sec13-mCherry na marlabel ERES konstitutif (ERES, magenta) Inkubasi bani suhu 37°C. Toruskon ma ai 30 menit, turunkon ma hu 24°C laho paluahkon sekresi, dob ai gambar ma marhitei SCLIM dob 20 menit. (A das hubani C) Gambar proyeksi 2D na mewakili (A; skala bar, 1μm) atap gambar belahan sel 3D (B pakon C; unit skala, 0,45μm) humbani 10 z-section na itandai marhitei kargo pakon ERES. Panel toruh i (B) pakon panel i (C) pataridahkon gambar na dob iproses laho pataridahkon pitah barang-barang na adong bani ERES (magenta) [Gas1-GFP (abu-abu) pakon Mid2-iRFP (biru muda)]. (C) Panah na iisi putih: ERES, barang tumpang tindih. Buka panah: ERES pitah marisi sada barang. Panel toruh: ERES na ipilih memiliki barang-barang na tumpang tindih (1 pakon 2) na itandai bani (C). Bar skala, 100 nm. (D) Kuantifikasi fotomikrograf na ipatugah bani (C). Bani unit GhLag1 sec31-1 pakon sec31-1, pitah sada muatan (Gas1-GFP atap Mid2-iRFP) do na imasukhon, pakon persentase rata-rata ERES untuk muatan na terisolasi pakon muatan na tumpang tindih. Bani tolu percobaan independen, n = 432 bani 54 sel (sec31-1) pakon n = 430 bani 47 sel (sec31-1 GhLag1). Bilah kesalahan = SD. Uji t dua ekor na lang marpasangan. *** P = 0.0002 (sec31-1) pakon ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Gambar 3D ERES na ipilih pakon muatan na tumpang tindih (3) na itandai bani (C). Gas1-GFP (hijau) pakon Mid2-iRFP (biru) mandohori ERES (magenta) humbani sisi na sarupa janah totap i daerah terbatas ERES na sarupa. Bar skala, 100 nm.
Penelitian on mambere bukti langsung in vivo bahwa kargo protein berbasis lipid iklasipikasihon gabe situs ekspor selektif bani jalur sekresi, pakon mangungkapkon pentingni ganjang rantai asil bani selektivitas klasifikasi. Marhiteihon sada teknik mikroskop na kuat pakon canggih na margoran SCLIM, hanami pataridahkon Gas1-GFP na baru isintesis (sada membran plasma utama GPI-AP pakon rantai asil na ganjang tumang (C26) porsi lipid seramida) bani ragi) Daerah-daerah na martumpu bani ER na terpisah berhubungan pakon ERES na khusus, sementara protein transmembran tersekresi melalui membran ERRES (Gambar 1). Leganni ai, dua jenis barang on masuk hu ERES na berbeda secara selektif (Gambar 2). Ganjang ni rantai asil ni seramida seluler bani membran iorui humbani C26 gabe C18-C16, kluster Gas1-GFP terganggu hu wilayah ER na terpisah, pakon Gas1-GFP iubah laho manadingkon ER pakon protein transmembran marhitei ERES na sarupa (Gambar 3 pakon Gambar 3). 4).
Hassi pe GPI-AP mamakei mekanisme protein khusus laho kaluar hun ER, jumpah hanami do anggo pemisahan na bergantung hubani ceramide C26 lang bergantung hubani interaksi protein na berbeda na boi mangarah hubani spesialisasi ERES (Gambar S4 pakon S5). Sebalikni, hasil penemuan nami mendukung mekanisme klasifikasi alternatif na idorong marhiteihon pengelompokan protein berbasis lipid pakon pengecualian kargo na legan. Pengamatan nami pataridahkon bahwa daerah Gas1-GFP atap kluster na berkaitan pakon ERES tertentu lang memiliki protein na isekresihon transmembran Mid2-iRFP, na pataridahkon bahwa kluster GPI-AP na bergantung hubani ceramide C26 akan memfasilitasi masukni sidea hu ERES na bersangkutan, janah bani panorang na sarupa, mengecualihon transmembran Sekresi masuk hu ERES khusus on (Gambar 12 pakon RES). Sebalikni, kehadiran C18-C16 ceramides bani membran ER lang mambahen GPI-AP mambahen daerah atap kluster, jadi sidea lang mengecualihon atap manggantihon protein na isekresihon transmembran hubani ERES na sarupa (Gambar 3 pakon 4). . Halani ai, iusulhon hanami ase C26 ceramide mendorong pemisahan pakon klasifikasi marhitei na memfasilitasi pengelompokan protein na mardomu hubani ERES na khusus.
Sonaha ase boi das hubani C26 ceramide-dependent clustering on hubagas sada daerah ER na khusus? Kecenderungan membran ceramide laho marsirang secara lateral boi mambahen GPI-AP pakon C26 ceramide mambahen lipid na etek pakon seketika na taratur bani lingkungan lipid na lang taratur humbani membran ER na marisi gliserolipid na pondok pakon lang jenuh. Kelompok kualitas (17, 18). Gugus-gugus sementara na etek on boi do lambin menyatu gabe gugus-gugus na lobih banggal, na lobih stabil dobkonsi mengikat hubani kompleks p24 (34). Domu hujin, ipatuduh hanami do anggo C26 Gas1-GFP porlu berinteraksi pakon kompleks p24 laho mambahen kluster na taridah na lobih banggal (Gambar 3). Kompleks p24 aima oligomer heterozigot na terdiri humbani ompat protein transmembran p24 na berbeda bani ragi (35), na mambere pengikatan multivalen, na boi mambahen pengikatan silang kluster GPI-AP na etek, sehingga menghasilhon kluster Stabil na lobih banggal (34). Interaksi antara ektodomain protein GPI-APs boi do homa berkontribusi hubani agregasi ni sidea, songon na taridah sanggah transportasi Golgi ni sidea bani sel epitel terpolarisasi mamalia (36). Tapi, sanggah C18-C16 ceramide adong bani membran ER, sanggah kompleks p24 mengikat hubani Gas1-GFP, lang terbentuk kelompok-kelompok na terpisah na banggal. Mekanisme na mendasari ai boi do bergantung hubani sifat fisik pakon kimia na khusus humbani keramida rantai asil na ganjang. Studi biofisika membran buatan pataridahkon bahwa pori pe seramida rantai asil na ganjang (C24) pakon na pondok (C18-C16) boi mambahen pemisahan fase, pitah seramida rantai asil na ganjang (C24) do na boi mendorong Lengkungan na gijang pakon bending film laho membentuk kembali film. Marhiteihon saling referensi (17, 37, 38). Domma ipatuduhkon bahwa heliks transmembran TMED2, homolog ni jolma Emp24, secara selektif berinteraksi pakon sphingomyelin berbasis ceramide C18 i lobus sitoplasma (39). Manggunahon simulasi dinamika molekuler (MD), jumpah hanami do bahwa C18 pakon C26 ceramides martumpu i sekitar lobus sitoplasma heliks transmembran Emp24, anjaha sidea memiliki preferensi na sarupa (Gambar S6). Porlu do ibotoh hita anggo on pataridahkon anggo heliks transmembran Emp24 boi mambahen distribusi lipid na lang simetris bani membran. On ma hasil na baru-baru on berdasarkon sel mamalia. Simulasi MD na sarupa pataridahkon homa kehadiran lipid eter (40) . Halani ai, hanami marsangka bahwa C26 ceramide bani dua lobus ER26 secara lokal iperkaya. Sanggah GPI-AP i lobus luminal langsung mengikat p24 multivalen pakon akumulasi C26 ceramide i sekitar p24 i lobus sitoplasma, on boi mendorong agregasi protein na mangiringkon pakon kelengkungan membran na ihasilhon marhitei jari-jari (41), mambahen GPI-AP terpisah hu daerah-daerah na terpisah na berdekatan pakon daerah-daerah na melengkung tinggi membran ER (42). Laporan sebelumni mendukung mekanisme na iusulhon (43, 44). Ikatan multivalen oligolektin, patogen atap antibodi hubani glikosfingolipid berbasis seramida (GSL) bani membran plasma mambahen agregasi GSL na banggal, meningkathon pemisahan fase pakon mambahen deformasi pakon internalisasi membran (44). Iwabuchi pnl. (43) Ijumpahi do anggo dong rantai asil na ganjang (C24) tapi lang pondok (C16), ligan multivalen na terikat hubani GSL laktosilseramida manginduksi pembentukan kluster na banggal pakon invaginasi membran, pakon transduksi sinyal na imediasi sitoplasma Lyn bani selebaran i interdigitasi rantai netropil na marpasangan.
Bani sel epitel na terpolarisasi mamalia, konsentrasi jaringan anti-Golgi (TGN) das hubani tingkat membran plasma apikal mengendalihon pemisahan pakon penyortiran GPI-AP (10, 45). Agregasi on idorong oligomerisasi GPI-AP (36), tapi boi do homa tergantung hubani ganjang ni rantai seramida na jumpah hita bani ragi. Hassi pe GPI-AP mamalia memiliki jangkar berbasis lipid eter, pakon struktur kimiani sangat berbeda humbani keramida rantai asil na sangat panjang, sada penelitian baru-baru on mandapotkon bahwa kedua lipid memiliki sifat fisik pakon kimia na sarupa secara evolusioner pakon fungsi (40). Halani ai, bagian lipid eter bani sel mamalia boi do sarupa pakon C26 ceramide bani ragi, anjaha peranni aima mardomu pakon ceramide rantai panjang bani membran laho mendorong agregasi pakon penyortiran GPI-AP. Hassi pe kemungkinan on porlu ope iuji secara langsung, hasil penemuan sebelumni mendukung bahwa transportasi keramida rantai asil na ganjang hubani badan Golgi lang idalankon marhiteihon protein transfer sitoplasma, tapi bergantung hubani sintesis jangkar GPI songon ragi. Halani ai, mekanisme konservatif evolusioner songon na boi secara selektif mangangkut rantai asil na ganjang tumang pakon GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) bani vesikel transportasi na sarupa.
Bani sistem sel epitel terpolarisasi ragi pakon mamalia, agregasi GPI-AP pakon pemisahan humbani protein membran plasma na legan haganupan terjadi paima das hu permukaan sel. Paladino et al. (48) mandapotkon bahwa bani TGN sel epitel terpolarisasi mamalia, pengelompokan GPI-AP lang pitah porlu bani klasifikasi selektif GPI-AP hubani membran plasma apikal, tapi dihut do homa mangatur organisasi pengelompokan GPI-AP pakon aktivitas biologisni. Permukaan sel. Bani ragi, penelitian on pataridahkon bahwa kluster GPI-AP na bergantung hubani C26 ceramide bani ER boi mangatur organisasi kluster pakon aktivitas fungsional GPI-AP bani membran plasma (24, 49). Domu hubani model on, sel GhLag1 alergi hubani inhibitor GPI atap obat-obat na mambahen integritas dinding sel (28), pakon porluni kluster Gas1-GFP na marfungsi (49) humbani seramida ujung na iproyeksihon bani kawin sel ragi pataridahkon G Kemungkinan konsekuensi fisiologis sel hLag1. GPI-AP error. Tapi, manguji selanjutni atap na domma iprogram organisasi fungsional permukaan sel humbani ER marhitei metode penyortiran berdasarhon ganjang ni lipid gabe subjek penelitian nami hu lobei ni ari.
Strain Saccharomyces cerevisiae na ipakei bani horja on isuratkon bani Tabel S1. MMY1583 pakon MMY1635 strain SCLIM untuk pencitraan sel hidup ipajongjong i latar belakang W303. Strain on na mengekspresihon Sec13-mCherry pakon tag protein fluoresen ibahen mamakei metode berbasis reaksi berantai polimerase (PCR) pakon plasmid pFA6a sebagai template (23). Strain na mengekspresihon Mid2-iRFP na ilabelhon pakon protein fluoresen i toruh ni kontrol promotor GAL1 ibangun songon na i toruh on. PCR amplifikasi urutan iRFP-KanMx humbani vektor pKTiRFP-KAN (hadiah ni E. O'Shea, nomor plasmid Addgene 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; pengidentifikasi sumber daya penelitian (RRID): Addgene_64687) Janah ipamasuk hubagas endogenous C2. Dobkonsi urutan genom Mid2-iRFP iperkuat pakon ikloning hubani promotor GAL1, ai iintegrasihon hubani situs Not I-Sac I plasmid integrasi pRS306. Plasmid pRGS7 na ihasilhon linierhon pakon Pst I laho mengintegrasihon hubani lokus URA3.
Gen fusi Gas1-GFP iekspresihon i toruh ni kontrol promotor GAL1 bani plasmid centromere (CEN), na ibangun songon na i toruh on. Urutan Gas1-GFP iperkuat marhitei PCR humbani plasmid pRS416-GAS1-GFP (24) (hadiah ni L. Popolo) pakon ikloning hu situs Xma I-Xho I plasmid CEN pBEVY-GL LEU2 (hadiah ni C). Miller; Addgene plasmid nomor 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Plasmid na ihasilhon igoran pRGS6. Gen fusi Axl2-GFP pe iekspresihon i toruh ni kontrol promotor GAL1 vektor pBEVY-GL LEU2, pakon konstruksi ni songon na i toruh on. Urutan Axl2-GFP iperkuat humbani plasmid pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) marhitei PCR, pakon ikloning hu situs Bam HI-Pst I vektor pBEVY-GL LEU2. Plasmid na ihasilhon igoran pRGS12. Urutan oligonukleotida na ipakei bani penelitian on isuratkon bani Tabel S2.
Galur ai itambahi pakon 0,2% adenin pakon 2% glukosa [YP-dekstrosa (YPD)], 2% rafinosa [YP-rafinosa] ekstrak ragi na bayak protein p (YP) medium (1 % ekstrak ragi pakon 2% protein ept). (YPR)] atap 2% galaktosa [YP-galaktosa (YPG)] sebagai sumber karbon, atap bani media minimal sintetis (0,15% basa nitrogen ragi pakon 0,5% amonium sulfat) laho manambahkon asam amino pakon basa na sosok na ihaporluhon bani nutrisi, pakon marisi 2% glukosa glukosa (2% media glukosa) atap media minimal galaktosa (medium minimal galaktosa sintetis) sebagai sumber karbon.
Bani pencitraan real-time, sel mutan sec31-1 na sensitif bani suhu na mengekspresihon konstruksi i toruh ni promotor GAL1 ipatubuh bani media YPR bani suhu 24°C saborngin das hubani fase mid-log. Dob induksi bani YPG bani suhu 24°C sadokah 1 jam, sel-sel ai i inkubasi bani SG bani suhu 37°C sadokah 30 menit, dob ai ipindahi hu 24°C laho paluahkon humbani blok sekresi. Concanavalin A ipakei laho padearhon sel-sel ai bani slide kaca janah igambarhon marhitei SCLIM. SCLIM aima kombinasi mikroskop fluoresensi terbalik Olympus IX-71 pakon lensa minyak bukaan numerik UPlanSApo 100×1.4 (Olympus), pemindai konfokal cakram berputar berkecepatan tinggi dan berrasio sinyal-ke-noise tinggi (Yokogawa Electric), spektrometer khusus, sistem intensifikasi gambar The (Hamamatsu Photonics) boi mambere sistem lensa pembesar pakon pembesaran akhir ×266.7 pakon kamera alat na marpasangan muatan na mangalihon elektron (Hamamatsu Photonics) (21). Pambuatan gambar ibahen marhiteihon perangkat lunak khusus (Yokogawa Electric). Bani gambar 3D, ipakei hanami do aktuator piezoelektrik na ibahen khusus laho manggetar lensa objektif secara vertikal, anjaha ipatumpu hanami bagian-bagian optik na marjarak 100 nm ibagas sada tumpukan. Gambar Z-stack iubah gabe data voxel 3D, pakon fungsi penyebaran titik teoritis na ipakei bani mikroskop konfokal cakram na marputar ipakei bani pemrosesan dekonvolusi marhitei perangkat lunak Volocity (PerkinElmer). Marhitei na mamakei perangkat lunak Volocity laho otomatis mambahen ambang untuk analisis ko-lokasi, ERES termasuk kargo iukur. Analisis scan garis ibahen mamakei perangkat lunak MetaMorph (Molecular Devices).
Manggunahon perangkat lunak GraphPad Prism laho manontuhon signifikansi statistik. Bani uji t-Student dua sisi pakon uji analisis varians satu arah biasa (ANOVA), perbedaan antar kelompok ianggap berdampak signifikan hubani P <0,05 (*).
Bani mikroskop fluoresensi Gas1-GFP, sel fase log itumbuhkon saborngin i YPD anjaha ipatumpu marhitei sentrifugasi, iburihi dua hali mamakei saline penyangga fosfat, dob ai i inkubasi i atas es sadokah 15 menit, dob ai ilanjutkon ma i toruh ni mikroskop songon na dob ipatugah hinan Cek (24). Mikroskop Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) na ilengkapi pakon lensa objektif, filter L5 (GFP), kamera Hamamatsu pakon perangkat lunak Application Suite X (LAS X) ipakei laho mambahen akuisisi. .
Sampel-sampel ai idenaturasi marhiteihon penyangga sampel SDS bani suhu 65°C sadokah 10 menit, dob ai ipisahon marhiteihon elektroforesis gel SDS-poliakrilamida (PAGE). Bani analisis imunoblotting, 10 μl sampel i muat per jalur. Antibodi primer: Manggunahon anti-Gas1 poliklonal kelinci bani pengenceran 1:3000, anti-Emp24 poliklonal kelinci bani pengenceran 1:500, pakon anti-GFP poliklonal kelinci (hadiah humbani H. Riezman) bani pengenceran 1:3000. Antibodi anti-Pgk1 monoklonal tikus ipakei bani pengenceran 1:5000 (hadiah humbani J. de la Cruz). Antibodi sekunder: Horseradish peroksidase (HRP) konjugasi kambing anti-kelinci immunoglobulin G (IgG) na ipakei bani pengenceran 1:3000 (Pierce). HRP-konjugasi kambing anti-tikus IgG ipakei bani pengenceran 1:3000 (Pierce). Zona respon imun iperhatihon marhitei metode chemiluminescence reagen SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Songon na dob ipatugah bani (31), sada percobaan imunopresipitasi alami ibahen bani fraksi ER na dob iperkaya. Singkatni, cuci ma sel ragi marhiteihon penyangga TNE [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM campuran phenylmethylsulfonyl fluoride pakon penghambat protease) bani 600 nm (OD600) bani 100 kepadatan optik dua hali. Iponggolhon ma ai marhitei manik-manik kaca, dob ai sisa-sisa sel pakon manik-manik kaca ai ipadaoh marhitei sentrifugasi. Supernatan ai dob ai i sentrifugasi bani 17.000 g sadokah 15 menit bani suhu 4°C. Pelet ai isuspensihon use bani TNE pakon digitalis saponin itambahkon hubani konsentrasi akhir 1%. Suspensi ai i inkubasi sadokah 1 jam marhiteihon rotasi bani suhu 4°C, dob ai komponen na lang larut ipadaoh marhitei sentrifugasi bani 13.000 g bani suhu 4°C sadokah 60 menit. Bani imunopresipitasi Gas1-GFP, parlobei pra-inkubasi ma sampel ai pakon manik-manik agarose kosong (ChromoTek) bani suhu 4°C sadokah 1 jam, dob ai inkubasi ma pakon GFP-Trap_A (ChromoTek) bani suhu 4°C sadokah 3 jam. Manik-manik na imunopresipitasi icuci lima hali marhitei TNE na marisi 0,2% digoxigenin, ielusi marhitei penyangga sampel SDS, ipisahon bani SDS-PAGE, dob ai ipareksa marhitei imunoblotting.
Songon na dob ipatugah bani (31), penentuan cross-linking ibahen bani fraksi ER na dob iperkaya. Singkatni, fraksi ER na dob iperkaya i inkubasi pakon 0,5 mM dithiobis (succinimidyl propionate) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 min). Reaksi silang ai ipadaoh marhitei na manambahkon glisin (50 mM konsentrasi akhir, 5 menit, 20°C).
Songon na dob ipatugah nongkan (50), analisis MS ceramide bani strain tipe liar pakon GhLag1 domma ibahen. Singkatni, sel-sel itumbuhkon das hubani fase eksponensial (3 ronsi 4 OD600 unit/ml) i YPD bani suhu 30°C, pakon 25×107 sel ipanen. Metabolisme ni sidea ipadaoh marhiteihon asam trikloroasetat. Pakei ma pelarut ekstraksi [etanol, bah, eter, piridin pakon 4,2 N amonium hidroksida (15:15:5:1:0,018 v/v)] pakon 1,2 nmol standar internal C17 ceramide (860517, Avanti polar lipid) kualitas). Pakei ma reagen monometilamin [metanol, bah, n-butanol pakon larutan metilamin (4:3:1:5 v/v)] laho mambahen hidrolisis basa ringan humbani ekstrak ai, dob ai pakei ma n-butanol na jenuh bah laho mananggali garam. Ujungni, ekstrak ai isuspensihon use bani pelarut mode positif [kloroform/metanol/bah (2:7:1) + 5 mM amonium asetat] dob ai isuntikkon hubagas spektrometer massa. Pemantauan multi-reaksi (MRM) ibahen laho mangindahi pakon mangukur molekul sphingolipid. Spektrometer massa quadrupole tersier TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) ilengkapi pakon sumber ion nanoflow robot Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) untuk analisis lipid. Energi tabrakan ioptimalhon bani ganup kategori seramida. Data MS idapot ibagas mode positif. Bani ganup replika biologis, sinyal lipid aima median humbani tolu pangukuran independen.
Songon na dob ipatugah bani (31), sel-sel (800×107) na mengekspresihon Gas1-GFP ibahen imunopresipitasi alami. Gas1-GFP na dob imurnihkon ipisahon marhitei SDS-PAGE dob ai ipindahi hubani membran poliviniliden fluorida (PVDF). Protein ai ivisualhon marhitei na manwarnai PVDF pakon hitam amida. Pita Gas1-GFP iponggol humbani PVDF anjaha iburihi 5 hali mamakei metanol pakon sahali mamakei bah kelas kromatografi cair-MS (LC-MS). Marhitei na manginkubasi strip membran pakon 500μl 0,3 M NaOAc (pH 4,0), penyangga pakon 500μl campuran natrium nitrit 1 M na baru larut bani suhu 37°C sadokah 3 jam, fraksi lipid ipaluah humbani Gas1-GFP pakon ilisis Pelepasan infosofaosin i antara glutefaosamin pakon seramin (51). Dob ai, strip membran ai icuci ompat hali mamakei bah kelas LC-MS, ikerangkon bani suhu kamar, anjaha isimpan bani atmosfer nitrogen bani -80°C ronsi analisis. Sebagai kontrol, sampel kosong membran PVDF ipakei bani ganup percobaan. Lipid na ibuat humbani Gas1-GFP dob ai ipareksa marhitei MS songon na dob ipatugah (50). Singkatni, strip PVDF na marisi GPI-lipid isuspensihon use bani 75μl pelarut cetakan negatif [kloroform/metanol (1:2) + 5 mM amonium asetat] pakon lulus ionisasi elektrospray (ESI)-MRM/MS Analisis spesies sphingolipid (TSQ Vantage). Bani kasus on, data MS idapot ibagas mode ion negatif.
Songon na dob isobut nongkan, bagian lipid ni jangkar GPI ipisahon humbani GPI-AP na marlabel [3H]-inositol (16). Lipid ipisahon marhitei kromatografi lapisan tipis mamakei sistem pelarut (55:45:10 kloroform-metanol-0,25% KCl) pakon ivisualhon mamakei FLA-7000 (Fujifilm).
Sel-sel na mengekspresihon Gas1-GFP (600×107) icuci dua hali marhiteihon penyangga TNE pakon penyangga TNE, dob ai iponggolhon marhiteihon manik-manik kaca, dob ai isentrifugasi laho padaohkon sisa-sisa sel pakon manik-manik kaca. Supernatan ai dob ai isentrifugasi bani 17.000 g sadokah 1 jam bani 4°C. Pelet ai icuci ibagas TNE janah iinkubasi pakon 1 U PI-PLC (Invitrogen) ibagas TNE na marisi 0,2% saponin digitalis sadokah 1 jam bani suhu 37°C. Dobkonsi perlakuan enzim, membran ai ipadaoh marhitei sentrifugasi bani 17.000 g bani suhu 4°C sadokah 1 jam. Laho imunopresipitasi Gas1-GFP, supernatan ai i inkubasi pakon GFP-Trap_A (ChromoTek) bani suhu 4°C saborngin. Gas1-GFP na dob imurnihkon na ipisahon marhitei SDS-PAGE iwarnai pakon Coomassie na marwarna biru na marsinalsal. Pita pewarnaan Gas1-GFP iponggol humbani warna abu-abu na manlinggomi aqueduct, dob ai dobkonsi alkilasi pakon iodoasetamida pakon reduksi pakon dithiothreitol, ibahen ma pencernaan in-gel pakon trypsin. Ekstrak pakon keringkon peptida triptik pakon peptida marhitei GPI-glikan. Peptida na dob kering ai ilarutkon bani 20 μl bah. Suntikkon ma sada porsi (8μl) hubagas LC. Sada kolom octadecylsilane (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; diameter bagas 150 mm×1.0 mm; Nomura Chemical, Prefektur Aichi, Jepang) ipakei laho mamisahkon peptida ibagas kondisi gradien na khusus. Fase bergerak aima pelarut A (0,08% asam formik) pakon pelarut B (0,15% asam formik ibagas 80% asetonitril). Sistem Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) ipakei laho mangelusi kolom pakon pelarut A ibagas 55 menit bani laju aliran 50 μl min-1 sadokah 5 menit, dob ai konsentrasi pelarut B itambahkon gabe 40%. , Amerika Serikat). Eluat ai torus ipamasuk hubagas sumber ion ESI, anjaha peptida tryptic pakon peptida na mar-GPI-glikan ipareksa marhitei LTQ Orbitrap XL (spektrometer massa perangkap ion linier hibrida-orbitrap; Thermo Fisher Scientific). Bani pengaturan MS, tegangan sumber kapiler iatur gabe 4,5 kV, pakon suhu kapiler transfer ijaga 300°C. Tegangan kapiler pakon tegangan lensa tabung ibahen gabe 15 V pakon 50 V, masing-masing. Data MS idapot bani mode ion positif (resolusi 60.000; akurasi massa 10 bagian per juta) bani rentang massa 300/m/z rasio massa/muatan (m/z) 3000. Data MS/MS idapot marhiteihon perangkap ion i Orbit LTQ [XL, data na parlobei, bergantung hubani digit data disosiasi na ibahen tabrakan (CID)].
Simulasi MD ibahen mamakei perangkat lunak GROMACS (52) pakon medan gaya MARTINI 2 (53-55). CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) dob ai ipakei laho mambahen lapisan ganda na marisi dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) pakon Cer C18 atap DOPC pakon Cer C26. Topologi pakon koordinat Cer C26 ibuat humbani DXCE marhitei na padaohkon manik-manik ekstra humbani ihur sfingosin. Pakei ma proses na ipatugah i toruh on laho menyeimbangkan lapisan ganda pakon manjalankon ai, dob ai pakei ma koordinat terakhir sistem laho mambangun sistem na marisi Emp24. Domain transmembran ragi Emp24 (residu 173 ronsi 193) ipajongjong sebagai α-heliks mamakei struktur molekuler alat visual MD (VMD) (58). Dob ai, dob ipadaoh lipid na tumpang tindih, protein ai i granulasi kasar janah ipamasuk hu lapisan ganda mamakei CHARMM GUI. Sistem na parpudi marisi 1202 DOPC pakon 302 Cer C26 atap 1197 DOPC pakon 295 Cer C18 pakon Emp24. Ionisasi sistem ai das hubani konsentrasi 0.150M. Ompat replika independen ibahen bani dua komposisi bilayer.
Lapisan ganda lipid iimbangi mamakei proses CHARMM GUI, na manlibathon meminimalhon dob ai menyeimbangkan 405.000 langkah, ija kendala posisi secara bertahap iurangi pakon ihilangkan, pakon langkah waktu itambahkon humbani 0,005 ps gabe 0,02 ps. Dobkonsi keseimbangan, ihasilhon ma 6 μs pakon langkah waktu 0,02 ps. Dobkonsi pamasukkon Emp24, pakei ma proses CHARMM GUI na sarupa laho meminimalhon pakon menyeimbangkan sistem, dob ai mardalan ma 8 s ibagas produksi.
Bani haganup sistem, sanggah proses penyeimbangan, tekanan ai ikontrol barostat Berendsen (59), anjaha sanggah proses produksi, tekanan ai ikontrol barostat Parrinello-Rahman (60). Bani haganup kasus, tekanan rata-rata aima 1 bar pakon skema kopling tekanan semi-isotropik ipakei. Bani proses keseimbangan pakon produksi, termostat (61) pakon kalibrasi ulang kecepatan ipakei laho manggabungkon suhu partikel protein, lipid pakon pelarut masing-masing. Sadokah ganup operasi, suhu target aima 310K. Interaksi non-bonding iparetongkon marhitei na mambahen daftar pasangan mamakei skema Verlet pakon toleransi penyangga 0,005. Istilah Coulomb iparetongkon mamakei medan reaksi pakon jarak potong 1,1 nm. Istilah Vander Waals mamakei skema cut-off pakon jarak cut-off 1,1 nm, pakon skema cut-off Verlet ipakei bani potensi penyimpangan (62).
Manggunahon VMD, panjang gelombang antara manik-manik fosfat DOPC atap manik-manik ceramide AM1 pakon protein aima 0,7 nm, anjaha bilangan ni lipid na berinteraksi pakon protein ai iparetongkon. Domu hubani rumus na i toruh on, etong ma faktor depletion-enrichment (DE) songon bani (63): DE faktor = (jumlah total lipid bani protein 0,7) bani protein 0,7 (jumlah Cer bani total lipid)
Nilai na ilaporhon dapot songon rata-rata, pakon bilah kesalahan aima ompat salinan independen humbani SE. Signifikansi statistik faktor DE iparetongkon marhitei t test [(averageDE-factor-1)/SE]. Etong ma nilai P humbani distribusi sada-ekor.
Alat GROMACS ipakei laho mangetong peta kepadatan lateral 2D sistem na marisi Emp24 ibagas 250 ns terakhir jejak. Ase boi dapot peta pengayaan/pengurangan ceramide, peta kepadatan Cer ibagi hubani jumlah peta Cer pakon DOPC, dob ai ibagi hubani konsentrasi Cer bani angkula. Skala peta warna na sarupa ipakei.
Anggo dong bahan tambahan bani artikel on, boi do ididah nasiam http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
On ma sada artikel akses terbuka na ibagihon mangihutkon syarat-syarat Lisensi Atribusi-Non-Komersial Creative Commons, na mangijinkon penggunaan, distribusi pakon reproduksi bani media aha pe, asal ma penggunaan akhir lang untuk keuntungan komersial pakon premisni aima anggo karya aslini domma sintong. Referensi.
Catatan: Hanami pitah mangindo ase nassiam mambere alamat email nassiam ase halak na isaranhon nassiam hu halaman on mambotoh anggo nassiam sihol mangidah email ai janah lang spam. Lang ra hanami manangkap alamat email.
Sungkun-sungkun on ipakei laho manguji atap na ham do pengunjung pakon mancegah pengiriman spam otomatis.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Lingio Serero, Logazhope (Serhope), (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Pencitraan real-time 3D resolusi tinggi pataridahkon pentingni ganjang ni rantai ceramide bani penyortiran protein bani situs output na selektif.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Lingio Serero, Logazhope (Serhope), (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Pencitraan real-time 3D resolusi tinggi pataridahkon pentingni ganjang ni rantai ceramide bani penyortiran protein bani situs output na selektif.
©2020 Asosiasi Amerika untuk Kemajuan Sains. haganup hak ipartahankon. AAAS aima mitra ni HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef pakon COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.