Metabolit imunomodulator aima fitur kunci lingkungan mikro tumor (TME), tapi pakon piga-piga pengecualian, identitas ni sidea totap do lang binotoh. Ijon, hanami menganalisa tumor pakon sel T humbani tumor pakon ascites ni pasien karsinoma serous tingkat tinggi (HGSC) laho pataridahkon metabolom ni kompartemen TME na berbeda on. Ascites pakon sel tumor memiliki perbedaan metabolit na ekstensif. Anggo ibandingkon pakon ascites, sel T na menyusup tumor secara signifikan ipabayak bani 1-methylnicotinamide (MNA). Hassi pe tingkat MNA bani sel T domma gijang, ekspresi nikotinamida N-metiltransferase (sada enzim na mangkatalisis transfer gugus metil humbani S-adenosylmetionine hubani nikotinamida) terbatas hubani fibroblas pakon sel tumor. Secara fungsional, MNA manginduksi sel T laho manluarhon faktor nekrosis tumor sitokin na mendorong tumor alpha. Halani ai, MNA na ibuat humbani TME mambere kontribusi hubani pengaturan kekebalan sel T pakon mewakili target imunoterapi na berpotensi laho mangubati kanker ni jolma.
Metabolit na ibuat humbani tumor boi do marpangkorhon penghambat na bagas bani kekebalan anti-tumor, anjaha lambin buei do bukti na pataridahkon anggo sidea boi do homa gabe pendorong kunci bani perkembangan ni naborit (1). Leganni efek Warburg, horja baru-baru on domma mulai mancirihon keadaan metabolisme sel tumor pakon hubunganni pakon keadaan kekebalan lingkungan mikro tumor (TME). Penelitian bani model tikus pakon sel T ni jolma domma patuduhkon bahwa metabolisme glutamin (2), metabolisme oksidatif (3) pakon metabolisme glukosa (4) boi bertindak secara independen bani bagei subkelompok sel imun. Piga-piga metabolit bani jalur on menghambat fungsi anti-tumor sel T. Domma terbukti bahwa blokade koenzim tetrahidrobiopterin (BH4) boi mambahen maseda proliferasi sel T, pakon peningkatan BH4 bani angkula boi meningkathon respon imun anti-tumor na imediasi CD4 pakon CD8. Leganni ai, efek imunosupresif ni kynurenine boi iselamatkon marhitei na mambere BH4 (5). Bani isocitrate dehydrogenase (IDH) mutan glioblastoma, sekresi enantiometabolic (R)-2-hydroxyglutarate (R-2-HG) menghambat aktivasi sel T, proliferasi pakon Aktivitas sitolisis (6). Baru-baru on, domma ipatuduhkon bahwa metilglioksal, produk sampingan glikolisis, iproduksi sel penekan na marharohan humbani myeloid, pakon transfer sel T metilglioksal boi menghambat fungsi sel T efektor. Bani pengobatan, netralisasi metilglioksal boi mangatasi aktivitas sel penekan na ibuat humbani myeloid (MDSC) pakon secara sinergis meningkathon terapi blokade pos pemeriksaan bani model tikus (7). Penelitian on secara kolektif menekanhon peran kunci metabolit na ibuat humbani TME bani na mangatur fungsi pakon aktivitas sel T.
Disfungsi sel T domma buei ilaporhon bani kanker ovarium (8). On sebagian halani sifat metabolisme na adong bani hipoksia pakon pembuluh darah tumor na lang normal (9), na mangkorhon konversi glukosa pakon triptofan gabe produk sampingan songon asam laktat pakon kynurenine. Laktat ekstraseluler na marlobih-lobih mangurangi produksi interferon-γ (IFN-γ) pakon mendorong diferensiasi subkelompok myelosuppressive (10, 11). Konsumsi triptofan secara langsung menghambat proliferasi sel T pakon menghambat pensinyalan reseptor sel T (12-14). Hassi pe dong pangamatan on, buei do horja na manlinggomi metabolisme imun na ibahen bani kultur sel T in vitro mamakei media na dob ioptimalhon, atap terbatas hubani model tikus homolog in vivo, na lang dong na mencerminhon heterogenitas kanker ni jolma pakon lingkungan makro pakon mikro fisiologis.
Sada fitur umum kanker ovarium aima penyebaran peritoneum pakon munculni ascites. Akumulasi cairan sel bani asma marpardomuan hubani naborit na domma parah pakon prognosis na lang dear (15). Domu hubani laporan, kompartemen na unik on aima hipoksik, memiliki tingkat faktor pertumbuhan endotel pembuluh darah (VEGF) pakon indoleamin 2,3-dioksigenase (IDO) na gijang, pakon i infiltrasi sel pengatur T pakon sel penghambat mieloid (15-18). Lingkungan metabolisme ni ascites boi do legan humbani tumor ai sandiri, halani ai pemrograman ulang sel T i ruang peritoneum lang jelas. Leganni ai, perbedaan kunci pakon heterogenitas antara ascites pakon metabolit na adong bani lingkungan tumor boi do menghambat infiltrasi sel imun pakon fungsini bani tumor, janah porlu do penelitian selanjutni.
Ase boi pasaloseihon masalah on, hanami merancang metode pemisahan sel sensitif pakon kromatografi cair tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) laho mamparlajari bagei jenis sel (termasuk sel T CD4 + pakon CD8 +) sonai homa i bagas pakon i tongah-tongah ni tumor Metabolitni manjangkau sel-sel na sarupa bani lingkungan ascites pakon tumor ni pasien. Igunahon hanami do metode on bersamaan pakon sitometri aliran dimensi tinggi pakon sekuensing RNA sel tunggal (scRNA-seq) laho mambere gambaran na dear pasal status metabolisme ni populasi kunci on. Metode on pataridahkon peningkatan na signifikan bani tingkat 1-methylnicotinamide (MNA) bani sel T tumor, pakon percobaan in vitro pataridahkon bahwa efek imunomodulator MNA bani fungsi sel T lape ongga ibotoh. Secara umum, metode on mangungkapkon interaksi metabolisme na saling antara tumor pakon sel imun, pakon mambere wawasan na unik hubani metabolit pengaturan imun, na boi marguna bani pengobatan peluang pengobatan imunoterapi kanker ovarium berbasis sel T.
Igunahon hanami sitometri aliran dimensi tinggi laho mangukur pengambilan glukosa secara serentak [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) pakon aktivitas mitokondria [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (77, 2019) i samping penanda khas na mambedahon sel imun pakon populasi sel tumor (Tabel S2 pakon Gambar S1A). Analisis on pataridahkon anggo ibandingkon pakon sel T, asma pakon sel tumor memiliki tingkat pengambilan glukosa na lobih gijang, tapi memiliki perbedaan na lobih etek bani aktivitas mitokondria. Rata-rata pengambilan glukosa sel tumor [CD45-EpCAM (EpCAM)+] aima tolu ronsi ompat hali lompit humbani sel T, pakon rata-rata pengambilan glukosa sel CD4 + T aima 1,2 hali lompit humbani sel CD8 + T, na pataridahkon limfosit infiltrasi tumor (TIL) memiliki kebutuhan metabolisme na berbeda bahkan bani gambar TAME na sarupa (Gambar 1). Sebalikni, aktivitas mitokondria bani sel tumor sarupa pakon sel CD4 + T, pakon aktivitas mitokondria bani kedua jenis sel ai lobih gijang marimbang sel CD8 + T (Gambar 1B). Secara umum, hasil on pataridahkon tingkat metabolisme. Aktivitas metabolisme sel tumor lobih gijang marimbang sel CD4 + T, pakon aktivitas metabolisme sel CD4 + T lobih gijang marimbang sel CD8 + T. Hassi pe dong efek-efek on bani ganup jenis sel, lang dong perbedaan na konsisten bani status metabolisme sel T CD4 + pakon CD8 + atap proporsi relatif ni sidea bani asma ibandingkon pakon tumor (Gambar 1C). Sebalikni, bani fraksi sel CD45, proporsi sel EpCAM+ bani tumor meningkat anggo ibandingkon pakon ascites (Gambar 1D). Iidah hanami do homa perbedaan metabolisme na jelas antara komponen sel EpCAM+ pakon EpCAM-. Sel EpCAM+ (tumor) memiliki pengambilan glukosa pakon aktivitas mitokondria na lobih gijang marimbang sel EpCAM-, na lobih gijang marimbang aktivitas metabolisme fibroblas bani sel tumor i TME (Gambar 1, E pakon F).
(A pakon B) Intensitas fluoresensi median (MFI) pengambilan glukosa (2-NBDG) (A) pakon aktivitas mitokondria sel CD4 + T (MitoTracker merah gelap) (B) Grafik representatif (kiri) pakon data na itabulasihon (Kanan), sel CD8 + T pakon EpCAM + CD45-sel tumor humbani tumor pakon tumor. (C) Rasio sel CD4 + pakon CD8 + (sel CD3 + T) bani asma pakon tumor. (D) Proporsi sel tumor EpCAM + bani ascites pakon tumor (CD45−). (E pakon F) EpCAM + CD45-tumor pakon EpCAM-CD45-matrix pengambilan glukosa (2-NBDG) (E) pakon aktivitas mitokondria (MitoTracker merah gelap) (F) grafik representatif (kiri) pakon data na itabulasihon (Kanan) Ascites pakon sel tumor. (G) Grafik representatif ekspresi CD25, CD137 pakon PD1 marhitei sitometri aliran. (H pakon I) CD25, CD137 pakon PD1 ekspresi bani sel CD4 + T (H) pakon sel T CD8 + (I). (J pakon K) Fenotipe naif, memori pusat (Tcm), efektor (Teff) pakon memori efektor (Tem) berdasarhon ekspresi CCR7 pakon CD45RO. Gambar representatif (hambirang) pakon data tabel (kanan) sel T CD4 + (J) pakon sel T CD8 + (K) bani asma pakon tumor. Nilai P itontuhon marhitei t-test na marpasangan (*P<0,05, **P<0,01 pakon ***P<0,001). Garis ai manggambarhon pasien na dob icocokkon (n = 6). FMO, fluoresensi minus sada; MFI, intensitas fluoresensi median.
Analisis selanjutni pataridahkon perbedaan na signifikan na legan antara status fenotipik sel T na domma isolsoli. Memori na iaktifkon (Gambar 1, G das hubani I) pakon memori efektor (Gambar 1, J pakon K) bani tumor lambin gati marimbangkon ascites (proporsi sel CD3 + T). Sonai homa, menganalisa fenotipe marhitei ekspresi penanda aktivasi (CD25 pakon CD137) pakon penanda deplesi [protein kematian sel terprogram 1 (PD1)] pataridahkon bahwa pori pe karakteristik metabolisme ni populasi on berbeda (Gambar S1, B ronsi E), Tapi lang dong perbedaan metabolisme na signifikan na konsisten ididah antara naif, atap subset efek memori (Gambar S1, F1) AU). Hasil on isahkon marhitei na mamakei metode pembelajaran mesin laho manontuhon fenotipe sel secara otomatis (21), na selanjutni pataridahkon kehadiran ni buei sel sumsum tulang (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) bani asma pasien (Gambar S2A ). Humbani ganup jenis sel na dob itanda, populasi sel myeloid on pataridahkon pengambilan glukosa pakon aktivitas mitokondria na tertinggi (Gambar S2, B ronsi G). Hasil on pataridahkon perbedaan metabolisme na kuat antara buei jenis sel na jumpah bani ascites pakon tumor bani pasien HGSC.
Tantangan utama laho mangarusi sifat-sifat metabolomik TIL aima porluni mangisolasi sampel sel T na cukup murni, berkualitas pakon kuantitas humbani tumor. Penelitian baru-baru on domma patuduhkon bahwa metode penyortiran pakon pengayaan manik-manik berdasarhon sitometri aliran boi do mambahen perubahan bani profil metabolit seluler (22-24). Laho mangatasi masalah on, ioptimalhon hanami do metode pengayaan manik-manik laho mangisolasi pakon mangisolasi TIL humbani kanker ovarium manusia na i reseksi secara bedah paima i analisis marhitei LC-MS/MS (idah Bahan pakon Metode; Gambar 2A). Laho menilai dampak keseluruhan protokol on bani perubahan metabolit, ibandingkon hanami profil metabolit sel T na iaktifkon donor na sehat dob ​​langkah pemisahan manik na i atas pakon sel na lang ipisahon manik tapi totap i atas es. Analisis kontrol kualitas on mandapotkon bahwa dong korelasi na gijang antara dua kondisi on (r = 0,77), pakon pengulangan teknis kelompok 86 metabolit memiliki pengulangan na gijang (Gambar 2B). Halani ai, metode on boi mambahen analisis metabolit na akurat bani sel na mengalami pengayaan jenis sel, sehingga mambere platform resolusi tinggi na parlobei laho mangidentifikasi metabolit tertentu bani HGSC, sehingga mambahen halak boi mandapot pangarusion na lobih bagas pasal spesifisitas sel Program metabolisme seksual.
(A) Diagram skematik pengayaan manik magnet. Paima ipareksa marhitei LC-MS/MS, sel-sel ai mandalani tolu putaran pengayaan manik magnetik na marturut-turut atap totap i atas es. (B) Pangkorhon ni jenis pengayaan bani buei ni metabolit. Rata-rata humbani tolu pangukuran bani ganup jenis pengayaan ± SE. Garis abu-abu manggambarhon hubungan 1:1. Korelasi intra-kelas (ICC) humbani pangukuran na iulakkon na ipatuduh bani label sumbu. NAD, nikotinamida adenin dinukleotida. (C) Diagram skematik alur kerja analisis metabolit pasien. Ascites atap tumor ipatumpu humbani pasien janah i awetkon. Sada bagian na etek humbani ganup sampel ipareksa marhitei flow cytometry, sementara sampel na tading ai mandalani tolu putaran pengayaan untuk sel CD4+, CD8+ pakon CD45-. Pecahan sel on ipareksa mamakei LC-MS/MS. (D) Peta panas humbani kelimpahan metabolit na dob ibakuhon. Dendrogram manggambarhon pengelompokan jarak Euclidean ni Ward antara sampel. (E) Analisis komponen utama (PCA) peta metabolit sampel, pataridahkon tolu replika humbani ganup sampel, sampel humbani pasien na sarupa ihubungkon marhitei sada garis. (F) PCA profil metabolit sampel na ikondisihon bani pasien (ai ma, mamakei redundansi parsial); jenis sampel ibatasi oleh lambung cembung. PC1, komponen utama 1; PC2, komponen utama 2.
Dob ai, iterapkon hanami ma metode pengayaan on laho menganalisa 99 metabolit bani fraksi sel CD4 +, CD8 + pakon CD45 bani asma primer pakon tumor ni onom pasien HGSC (Gambar 2C, Gambar S3A pakon Tabel S3 pakon S4). Populasi na iharosuhkon mambere 2% ronsi 70% humbani sampel sel na manggoluh na banggal, anjaha proporsi sel ai marbeda-beda do antara pasien. Dob ipisahon manik-manik ai, fraksi na iperkaya na iharosuhkon (CD4+, CD8+ atap CD45-) lobih humbani 85% humbani ganup sel na manggoluh bani sampel ai rata-rata. Metode pengayaan on mambahen hita boi menganalisa populasi sel humbani metabolisme jaringan tumor ni jolma, na lang mungkin ibahen humbani sampel na banggal. Marhitei protokol on, itontuhon hanami ma anggo l-kynurenine pakon adenosine, dua metabolit imunosupresif na dear on domma meningkat bani sel T tumor atap sel tumor (Gambar S3, B pakon C). Halani ai, hasil on pataridahkon kesetiaan pakon kemampuan teknologi pemisahan sel pakon spektrometri massa nami laho mangindahi metabolit na ponting secara biologis bani jaringan pasien.
Analisis nami pe pataridahkon pemisahan metabolisme na kuat humbani jenis sel ibagas pakon antara pasien (Gambar 2D pakon Gambar S4A). Secara khusus, anggo ibandingkon pakon pasien na legan, pasien 70 pataridahkon karakteristik metabolisme na berbeda (Gambar 2E pakon Gambar S4B), na pataridahkon bahwa mungkin adong heterogenitas metabolisme na substansial antara pasien. Porlu do botohon anggo ibandingkon pakon pasien na legan (1,2 ronsi 2 liter; Tabel S1), total ascites na ipatumpu bani pasien 70 (80 ml) lambin etek. Kontrol heterogenitas antar pasien sanggah analisis komponen utama (misalni, mamakei analisis redundansi parsial) pataridahkon parubahan na konsisten antara jenis sel, pakon jenis sel pakon/atap lingkungan mikro na jelas ipatumpu domu hubani profil metabolit (Gambar 2F ). Analisis metabolit tunggal menekanhon efek-efek on pakon pataridahkon perbedaan na signifikan antara jenis sel pakon lingkungan mikro. Porlu do ibotoh hita anggo perbedaan na paling ekstrim na ididah aima MNA, na somalni iperkaya bani sel CD45- pakon bani sel CD4+ pakon CD8+ na menyusup hu tumor (Gambar 3A). Bani sel CD4 +, efek on paling jelas, pakon MNA bani sel CD8 + pe songon na sangat terpengaruh hubani lingkungan. Tapi, on lang pala porlu, halani pitah tolu humbani onom pasien na boi dievaluasi skor CD8+ tumor. Leganni MNA, bani bagei-bagei jenis sel bani asma pakon tumor, metabolit na legan na lang dear itandahon bani TIL pe bayak secara berbeda (Gambar S3 pakon S4). Halani ai, data on pataridahkon sada set metabolit imunomodulator na menjanjihon untuk penelitian selanjutni.
(A) Kandungan MNA na dob inormalhon bani sel CD4+, CD8+ pakon CD45- humbani asma pakon tumor. Plot kotak pataridahkon median (garis), rentang antarkuartil (engsel bingkai) pakon rentang data, das hubani 1,5 hali rentang antarkuartil (kumis bingkai). Songon na dob ipatugah bani Bahan pakon Metode Pasien, pakei ma nilai limma pasien laho manontuhon nilai P (*P<0,05 pakon **P<0,01). (B) Diagram skematik metabolisme MNA (60). Metabolit: S-adenosyl-1-methionine; SAH, S-adenosine-1-homocysteine; NA, nikotinamida; MNA, 1-methylnicotinamide; 2-PY, 1-metil- 2-piridon-5-karboksamida; 4-PY, 1-metil-4-piridon-5-karboksamida; NR, nikotinamida ribosa; NMN, nikotinamida mononukleotida. Enzim (hijau): NNMT, nikotinamida N-metiltransferase; SIRT, sirtuins; NAMPT, nicotinamide phosphoribosyl transferase; AOX1, aldehida oksidase 1; NRK, nikotinamida ribosida kinase; NMNAT, nikotinamida mono Nukleotida adenilat transferase; Pnp1, purin nukleosida fosforilase. (C) t-SNE ni scRNA-seq ni ascites (abu-abu) pakon tumor (merah; n = 3 pasien). (D) Ekspresi NNMT bani populasi sel na berbeda na itanda mamakei scRNA-seq. (E) Ekspresi NNMT pakon AOX1 bani SK-OV-3, ginjal embrionik manusia (HEK) 293T, sel T pakon sel T na irawat MNA. Ekspresi na marlipat ai ipatuduh relatif hubani SK-OV-3. Pola ekspresi pakon SEM ipatuduh (n = 6 donor na sehat). Nilai Ct lobih humbani 35 ianggap lang boi ideteksi (UD). (F) Ekspresi SLC22A1 pakon SLC22A2 bani SK-OV-3, HEK293T, sel T pakon sel T na irawat pakon 8mM MNA. Ekspresi na marlipat ai ipatuduh relatif hubani SK-OV-3. Pola ekspresi pakon SEM ipatuduh (n = 6 donor na sehat). Nilai Ct lobih humbani 35 ianggap lang boi ideteksi (UD). (G) Isi MNA sel bani sel T donor sehat na iaktifkon dob 72 jam inkubasi pakon MNA. Pola ekspresi pakon SEM ipatuduh (n = 4 donor na sehat).
MNA iproduksi marhitei na papindahkon gugus metil humbani S-adenosyl-1-metionine (SAM) hubani nikotinamida (NA) marhitei nikotinamida N-metiltransferase (NNMT; Gambar 3B). NNMT iekspresihon secara berlebihan bani bagei kanker ni jolma janah marpardomuan hubani proliferasi, invasi pakon metastasis (25-27). Ase lambin iarusi hita sumber MNA bani sel T i TME, ipakei hanami scRNA-seq laho mancirihon ekspresi NNMT bani ganup jenis sel bani asma pakon tumor ni tolu pasien HGSC (Tabel S5). Analisis hira-hira 6.500 sel pataridahkon bahwa bani lingkungan asma pakon tumor, ekspresi NNMT terbatas hubani populasi sel fibroblas pakon tumor na ianggap (Gambar 3, C pakon D). Porlu do ibotoh hita bahasa lang dong ekspresi NNMT na jelas bani populasi na mengekspresihon PTPRC (CD45 +) (Gambar 3D pakon Gambar S5A), na pataridahkon anggo MNA na tardeteksi bani spektrum metabolit domma ipamasuk hubagas sel T. Ekspresi aldehid oksidase 1 (AOX1) mangubah MNA gabe 1-metil-2-piridon-5-karboksamida (2-PYR) atap 1-metil-4-piridon-5-karboksamida (4-PYR); Gambar 3B) pe ibatasi hubani populasi fibroblas na mengekspresihon COL1A1 (Gambar S5A), na rap pataridahkon bahwa sel T lang memiliki kemampuan metabolisme MNA konvensional. Pola ekspresi gen na marpardomuan hubani MNA on iverifikasi mamakei data sel independen paduahon humbani ascites humbani pasien HGSC (Gambar S5B; n = 6) (16). Leganni ai, analisis reaksi berantai polimerase kuantitatif (qPCR) sel T donor na sehat na irawat marhitei MNA pataridahkon anggo ibandingkon pakon sel tumor ovarium SK-OV-3 kontrol, NNMT atap AOX1 hampir lang iekspresihon (Gambar 3E). Hasil na lang isangka on pataridahkon bahwa MNA boi do isekresihon humbani fibroblas atap tumor hu sel T na berdekatan i TME.
Hassi pe kandidat termasuk keluarga transporter kation organik 1 ronsi 3 (OCT1, OCT2 pakon OCT3) na ikodehon oleh keluarga pembawa larut 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 pakon SLC22A3), transporter potensial MNA lape iartihon (28) . QPCR mRNA humbani sel T donor na sehat pataridahkon tingkat ekspresi SLC22A1 na rendah tapi tingkat SLC22A2 na lang boi ideteksi, na memastikan domma ongga ilaporhon bani literatur (Gambar 3F) (29). Sebalikni, garis sel tumor ovarium SK-OV-3 mengekspresihon tingkat na gijang humbani kedua transporter (Gambar 3F).
Laho manguji kemungkinan sel T memiliki kemampuan menyerap MNA asing, sel T donor na sehat ikulturhon sadokah 72 jam ibagas kehadiran konsentrasi MNA na berbeda. Anggo lang dong MNA eksogen, isi seluler ni MNA lang boi ideteksi (Gambar 3G). Tapi, sel T na iaktifkon na irawat marhitei MNA eksogen pataridahkon peningkatan kandungan MNA na bergantung hubani dosis bani sel, das hubani 6 mM MNA (Gambar 3G). Hasil on pataridahkon bahwa pori pe rendah tingkat ekspresi transporter pakon hurangni enzim utama na bertanggung jawab bani metabolisme MNA intraseluler, TIL boi ope mangalop MNA.
Spektrum metabolit bani sel T pasien pakon percobaan penyerapan MNA in vitro meningkatkon kemungkinan bahwa fibroblas na berhubungan pakon kanker (CAF) mengeluarhon MNA pakon sel tumor boi mangatur fenotipe pakon fungsi TIL. Laho manontuhon pengaruh ni MNA bani sel T, sel T donor na sehat iaktifkon in vitro bani kehadiran atap lang MNA, pakon proliferasi pakon produksi sitokin ni dievaluasi. Dob 7 ari manambahkon MNA bani dosis tertinggi, jumlah penggandaan populasi sedang berkurang, sementara kekuatan terjaga bani haganup dosis (Gambar 4A). Leganni ai, pengobatan MNA eksogen mangkorhon peningkatan proporsi sel T CD4 + pakon CD8 + na mengekspresihon faktor nekrosis tumor-α (TNFα; Gambar 4B). Sebalikni, produksi intraseluler IFN-γ markurang secara signifikan bani sel T CD4 +, tapi lang bani sel T CD8 +, anjaha lang dong perubahan na signifikan bani interleukin 2 (IL-2; Gambar 4, C pakon D). Halani ai, tes imunosorben na mardomu hubani enzim (ELISA) humbani supernatan humbani kultur sel T na irawat MNA on pataridahkon peningkatan TNFα na signifikan, penurunan IFN-γ, pakon lang dong perubahan IL-2 (Gambar 4, E ronsi G). . Penurunan IFN-γ pataridahkon bahwa MNA boi berperan laho menghambat aktivitas anti-tumor sel T. Ase boi mansimulasihon efek ni MNA bani sitotoksisitas na imediasi sel T, sel reseptor antigen chimeric T (FRα-CAR-T) na martujuan hubani reseptor folat α pakon CAR-T (GFP) na iatur sel protein neon hijau (GFP) -CAR-T) iproduksi sel mononuklear darah tepi donor na sehat (PBMC). Sel CAR-T ikulturhon sadokah 24 jam i lobei ni MNA, dob ai ikulturhon rap pakon sel tumor ovarium SK-OV-3 ni jolma na mengekspresihon reseptor folat α bani rasio efektor hubani target 10:1. Pengobatan MNA mangkorhon penurunan na signifikan bani aktivitas pembunuhan sel FRα-CAR-T, na mirip pakon sel FRα-CAR-T na irawat marhitei adenosin (Gambar 4H).
(A) Total bilangan sel na boi manggoluh pakon penggandaan populasi (PD) langsung humbani kultur bani ari 7. Grafik batang manggambarhon rata-rata + SEM humbani onom donor na sehat. Manggambarhon data humbani saotikni n = 3 percobaan independen. (B das hubani D) CD3/CD28 pakon IL-2 ipakei laho mangaktifkon sel T bani konsentrasi MNA ni bei sadokah 7 ari. Paima ibahen analisis, sel-sel irangsang marhitei PMA/ionomycin pakon GolgiStop sadokah 4 jam. TNFα (B) ekspresi bani sel T. Contoh gambar (hambirang) pakon data tabel (kanan) ekspresi TNFα bani sel na manggoluh. IFN-γ (C) pakon IL-2 (D) ekspresi bani sel T. Ekspresi sitokin iukur marhitei sitometri aliran. Grafik batang manggambarhon rata-rata (n = 6 donor na sehat) + SEM. Manggunahon analisis varians sada arah pakon pangukuran na mangulang (*P<0.05 pakon **P<0.01) laho manontuhon nilai P. Manggambarhon data humbani saotikni n = 3 percobaan independen. (E das hubani G) CD3/CD28 pakon IL-2 ipakei laho mangaktifkon sel T bani konsentrasi MNA ni bei sadokah 7 ari. Media ai ipatumpu paima pakon dob 4 jam stimulasi PMA/ionomycin. Konsentrasi TNFα (E), IFN-γ (F) pakon IL-2 (G) iukur marhitei ELISA. Grafik batang manggambarhon rata-rata (n = 5 donor na sehat) + SEM. Nilai P itontuhon mamakei analisis varians sada arah pakon pangukuran na mangulang (*P<0.05). Garis titik-titik ai pataridahkon batas deteksi ni deteksi ai. (H) Assay lisis sel. Sel FRα-CAR-T atap GFP-CAR-T iubah marhiteihon adenosin (250μM) atap MNA (10 mM) sadokah 24 jam, atap ipaturut lang irawat (Ctrl). Persentase pembunuhan sel SK-OV-3 domma iukur. Nilai P itontuhon marhitei uji t Welch (*P<0.5 pakon **P<0.01).
Ase boi dapot pangarusion mekanistik pasal pengaturan ekspresi TNFα na bergantung hubani MNA, parubahan mRNA TNFα sel T na irawat MNA dievaluasi (Gambar 5A). Sel T donor na sehat na irawat marhitei MNA pataridahkon peningkatan dua hali lipat bani tingkat transkripsi TNFα, na pataridahkon bahwa MNA bergantung hubani pengaturan transkripsi TNFα. Laho mamareksa mekanisme pengaturan na mungkin on, dua faktor transkripsi na dob ibotoh na mangatur TNFα, aima faktor inti sel T na iaktifkon (NFAT) pakon protein spesifik 1 (Sp1), dievaluasi sebagai respon hubani pengikatan MNA hubani promotor TNFα proksimal ( 30). Promotor TNFα marisi 6 situs pengikatan NFAT na dob itanda pakon 2 situs pengikatan Sp1, tumpang tindih bani sada situs [-55 pasangan basa (bp) humbani 5'cap] (30). Imunopresipitasi kromatin (ChIP) pataridahkon anggo irawat marhitei MNA, pengikatan Sp1 hubani promotor TNFα martambah tolu hali lompit. Penggabungan NFAT pe meningkat janah dohor hubani kepentingan (Gambar 5B). Data on pataridahkon bahwa MNA mangatur ekspresi TNFα marhiteihon transkripsi Sp1, pakon ekspresi NFAT na lobih etek.
(A) Ibandingkon pakon sel T na ikulturhon tanpa MNA, perubahan lipatan ekspresi TNFα bani sel T na irawat pakon MNA. Pola ekspresi pakon SEM ipatuduh (n = 5 donor na sehat). Manggambarhon data humbani saotikni n = 3 percobaan independen. (B) Promotor TNFα sel T na irawat marhitei atap lang 8 mM MNA dob NFAT pakon Sp1 ipadomu pakon (Ctrl) pakon stimulasi PMA/ionomycin sadokah 4 jam. Imunoglobulin G (IgG) pakon H3 ipakei sebagai kontrol negatif pakon positif untuk imunopresipitasi, masing-masing. Kuantifikasi ChIP pataridahkon bahwa pengikatan Sp1 pakon NFAT hubani promotor TNFα bani sel na irawat MNA martambah piga-piga hali ibandingkon pakon kontrol. Manggambarhon data humbani saotikni n = 3 percobaan independen. Nilai P itontuhon marhiteihon buei t-test (*** P <0.01). (C) Ibandingkon hubani asma HGSC, sel T (non-sitotoksik) pataridahkon peningkatan ekspresi TNF bani tumor. Warna-warna ai manggambarhon pasien na berbeda. Sel na ipatuduh domma ipilih secara acak gabe 300 pakon i jitter laho mambatasi overdrawing (** Padj = 0.0076). (D) Model MNA na iusulhon bani kanker ovarium. MNA iproduksi bani sel tumor pakon fibroblas i TME anjaha ibuat sel T. MNA meningkathon pengikatan Sp1 hubani promotor TNFα, na mambahen meningkat transkripsi TNFα pakon produksi sitokin TNFα. MNA pe mambahen penurunan IFN-γ. Penghambatan fungsi sel T mambahen kemampuan mamunuh na moru pakon pertumbuhan tumor na lambin podas.
Domu hubani laporan, TNFα memiliki efek anti-tumor pakon anti-tumor na bergantung i lobei pakon i pudi, tapi domma tarbarita peranni laho mendorong pertumbuhan pakon metastasis kanker ovarium (31-33). Domu hubani laporan, konsentrasi TNFα bani ascites pakon jaringan tumor bani pasien kanker ovarium lobih gijang marimbang jaringan jinak (34-36). Bani segi mekanisme, TNFα boi mangatur aktivasi, fungsi pakon proliferasi sel darah putih, pakon mangubah fenotipe sel kanker (37, 38). Domu hubani hasil on, analisis ekspresi gen diferensial pataridahkon bahwa TNF secara signifikan i-up-regulate bani sel T bani jaringan tumor ibandingkon pakon ascites (Gambar 5C). Peningkatan ekspresi TNF pitah taridah bani populasi sel T na marfenotipe non-sitotoksik (Gambar S5A). Singkatni, data on mendukung pandangan bahwa MNA memiliki efek imunosupresif pakon promosi tumor ganda bani HGSC.
Pelabelan neon berdasarhon sitometri aliran domma gabe metode utama laho mamparlajari metabolisme TIL. Penelitian on domma patuduhkon anggo ibandingkon pakon limfosit darah tepi atap sel T humbani organ limfoid sekunder, TIL tikus pakon jolma memiliki kecenderungan na lobih gijang laho mangalop glukosa (4, 39) pakon hilangni fungsi mitokondria secara bertahap (19, 40). Hassi pe domma ididah hanami hasil na sarupa bani penelitian on, perkembangan kunci aima mambandingkon metabolisme sel tumor pakon TIL humbani jaringan tumor na sarupa na i reseksi. Domu hubani piga-piga laporan sebelumni, sel tumor (CD45-EpCAM +) humbani ascites pakon tumor memiliki pengambilan glukosa na lobih gijang marimbang sel CD8 + pakon CD4 + T, na mendukung bahwa pengambilan glukosa na gijang humbani sel tumor boi ibandingkon pakon sel T. Konsep persaingan sel T. TME. Tapi, aktivitas mitokondria sel tumor lobih gijang marimbang sel CD8 + T, tapi aktivitas mitokondria sarupa pakon sel CD4 + T. Hasil on patoguhkon tema na baru tubuh bahwa metabolisme oksidatif ponting bani sel tumor (41, 42). Ihatahon sidea do homa anggo sel T CD8 + ra do lobih rentan hubani disfungsi oksidatif marimbang sel T CD4 +, atap sel T CD4 + ra do mamakei sumber karbon na legan sobali glukosa laho manramotkon aktivitas mitokondria (43, 44). Porlu do ibotoh hita anggo hanami lang mangidah perbedaan bani pengambilan glukosa atap aktivitas mitokondria antara efektor CD4 + T, memori efektor T pakon sel memori pusat T bani ascites. Sonai homa, keadaan diferensiasi sel T CD8 + bani tumor lang dong hubunganna hubani parubahan pengambilan glukosa, na pataridahkon perbedaan na signifikan antara sel T na ibudidayahon in vitro pakon TIL ni jolma in vivo (22). Pengamatan on pe isahkon marhitei na mamakei alokasi populasi sel otomatis na lang bias, na selanjutni mangungkapkon bahwa sel CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + na lobih gijang pengambilan glukosa pakon aktivitas mitokondria marimbang sel tumor domma merajalela tapi memiliki populasi sel aktif Metabolik. Populasi on boi mewakili subpopulasi na ianggap sel penekan mieloid atap sel dendritik plasmasitoid na itandahon bani analisis scRNA-seq. Hassi pe haduasi on domma ilaporhon bani tumor ovarium ni jolma [45], porlu ope horja selanjutni laho manggambarhon subpopulasi myeloid on.
Hassi pe metode berbasis sitometri aliran boi patangkashon perbedaan umum glukosa pakon metabolisme oksidatif antara jenis sel, metabolit na tepat na ihasilhon glukosa atap sumber karbon na legan untuk metabolisme mitokondria i TME lape itontuhon. Mambere kehadiran atap lang metabolit hubani subset TIL na ibere mamorluhon pemurnian populasi sel humbani jaringan na iponggol. Halani ai, metode pengayaan sel nami ipadomu pakon spektrometri massa boi mambere wawasan hubani metabolit na berbeda-beda iperkaya bani sel T pakon populasi sel tumor bani sampel pasien na cocok. Hassi pe metode on memiliki keunggulan marimbang penyortiran sel na iaktifkon fluoresensi, piga-piga perpustakaan metabolit boi do terpengaruh halani stabilitas na melekat pakon/atap tingkat pergantian na cepat (22). Hassi pe sonai, metode nami boi mangidentifikasi dua metabolit imunosupresif na iakui, adenosin pakon kynurenine, halani sidea berbeda-beda antara jenis sampel.
Analisis metabolomik nami pasal tumor pakon subtipe TIL mambere lobih bahat wawasan pasal peran ni metabolit bani TME ovarium. Parlobei, mamakei flow cytometry, itontuhon hanami lang dong perbedaan bani aktivitas mitokondria antara tumor pakon sel CD4 + T. Tapi, analisis LC-MS/MS pataridahkon parubahan na signifikan bani buei ni metabolit i tongah-tongah ni populasi on, na pataridahkon anggo kesimpulan pasal metabolisme TIL pakon aktivitas metabolismeni secara keseluruhan porlu do iartihon secara cermat. Na paduahon, MNA aima metabolit na paling banggal perbedaan antara sel CD45 pakon sel T bani ascites, lang tumor. Halani ai, kompartementalisasi pakon ianan tumor boi do marbeda efekni bani metabolisme TIL, na pataridahkon kemungkinan heterogenitas bani lingkungan mikro na ibere. Patoluhon, ekspresi enzim penghasil MNA NNMT terutama terbatas hubani CAF, aima sel tumor na lobih etek, tapi tingkat MNA na boi ideteksi ididah bani sel T na berasal humbani tumor. Ekspresi na marlobih-lobih NNMT bani CAF ovarium memiliki efek na mendorong kanker na dob ibotoh, sebagian halani promosi metabolisme CAF, invasi tumor pakon metastasis (27). Hassi pe tingkat TIL secara keseluruhan sedang, ekspresi NNMT bani CAF erat do hubunganna hubani subtipe mesenkim Cancer Genome Atlas (TCGA), na marpardomuan hubani prognosis na lang dear (27, 46, 47). Ujungni, ekspresi enzim AOX1 na bertanggung jawab bani degradasi MNA terbatas do homa hubani populasi CAF, na pataridahkon bahwa sel T lang mampu memetabolisme MNA. Hasil on mendukung gagasan bahwa pori pe porlu do horja selanjutni laho memverifikasi hasil on, tingkat MNA na gijang bani sel T boi do pataridahkon kehadiran lingkungan mikro CAF imunosupresif.
Halani tingkat ekspresi transporter MNA na rendah pakon tingkat protein kunci na lang tardeteksi na terlibat bani metabolisme MNA, kehadiran MNA bani sel T lang isangka. NNMT atap AOX1 lang boi ideteksi marhitei analisis scRNA-seq pakon qPCR na itargetkan humbani dua kohort independen. Hasil on pataridahkon bahwa MNA lang isintesis sel T, tapi iserap humbani TME na i sekitarni. Percobaan in vitro pataridahkon bahwa sel T cenderung menumpuk MNA eksogen.
Penelitian in vitro nami domma patuduhkon bahwa MNA eksogen manginduksi ekspresi TNFα bani sel T pakon meningkathon pengikatan Sp1 hubani promotor TNFα. Hassi pe TNFα memiliki fungsi anti-tumor pakon anti-tumor, bani kanker ovarium, TNFα boi mendorong pertumbuhan kanker ovarium (31-33). Netralisasi TNFα bani kultur sel tumor ovarium atap penghapusan sinyal TNFα bani model tikus boi meningkathon produksi sitokin inflamasi na imediasi TNFα pakon menghambat pertumbuhan tumor (32, 35). Halani ai, bani kasus on, MNA na ibuat humbani TME boi bertindak sebagai metabolit pro-inflamasi marhiteihon mekanisme na bergantung hubani TNFα marhiteihon lingkaran autokrin, sehingga mendorong terjadini pakon penyebaran kanker ovarium (31). Mardasarhon kemungkinan on, blokade TNFα ipelajari sebagai agen terapeutik na berpotensi bani kanker ovarium (37, 48, 49). Leganni ai, MNA mambahen ganggu sitotoksisitas sel CAR-T hubani sel tumor ovarium, na mambere bukti selanjutni bani penindasan kekebalan na imediasi MNA. Secara kolektif, hasil on menunjukkan model ija tumor pakon sel CAF mengeluarhon MNA hubagas TME ekstraseluler. Marhitei (i) stimulasi pertumbuhan kanker ovarium na ibahen TNF pakon (ii) penghambatan aktivitas sitotoksik sel T na ibahen MNA, on boi do marpangkorhon tumor ganda (Gambar 5D).
Kesimpulanni, marhitei na manggunahon kombinasi pengayaan sel na cepat, sekuensing sel tunggal pakon profil metabolisme, penelitian on mangungkapkon perbedaan imunometabolomik na banggal antara tumor pakon sel ascites bani pasien HGSC. Analisis komprehensif on pataridahkon dong perbedaan bani pengambilan glukosa pakon aktivitas mitokondria antara sel T, pakon mangidentifikasi MNA sebagai metabolit pengatur kekebalan otonom non-sel. Data on marpangkorhon hubani sonaha TME mambahen metabolisme sel T bani kanker ni jolma. Hassi pe domma ilaporhon persaingan langsung bani nutrisi antara sel T pakon sel kanker, metabolit boi do homa bertindak sebagai pengatur na lang langsung laho mendorong perkembangan tumor pakon mungkin menekan respon imun endogen. Gambaran selanjutni pasal peran fungsional ni metabolit pengatur on boi mambuka strategi alternatif laho meningkathon respon imun anti-tumor.
Spesimen pasien pakon data klinis idapot marhitei repositori jaringan tumor kanker BC na isertifikasi oleh Jaringan Repositori Jaringan Kanada. Domu hubani protokol na dob isetujui Komite Etika Penelitian Kanker BC pakon Universitas British Columbia (H07-00463), haganup spesimen pasien pakon data klinis dapotan persetujuan tertulis na dob ibotoh atap secara resmi manadingkon persetujuan ni sidea. Sampel ai isimpan i BioBank na dob isertifikasi (BRC-00290). Karakteristik pasien na rinci ipatuduh bani Tabel S1 pakon S5. Bani kriopreservasi, sada pisau pisau ipakei laho mangurai sampel tumor pasien secara mekanis dob ai idorong ma ai marhitei filter 100 mikron laho mandapotkon suspensi sel tunggal. Ascites ni pasien i sentrifugasi bani 1500 rpm sadokah 10 menit bani suhu 4°C laho mambahen pelet sel-sel pakon padaohkon supernatan. Sel na dapot humbani tumor pakon ascites i kriopreservasi ibagas 50% serum AB manusia na inaktifkon panas (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) pakon 10% dimetil sulfoksida. Suspensi sel tunggal na dob ipertahankon on icairkon janah ipakei bani metabolomik pakon penentuan metabolit na ipatugah i toruh on.
Media na lengkap terdiri humbani 0,22 μm na isaring 50:50 na itambahi RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) itambahi pakon 10% serum AB manusia na inaktifkon panas (Sigma-Aldrich), 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) x1 Penisilin Streptomisin (PenStrep) larutan (Thermo Fisher Scientific) pakon 50 μMB-mercaptoethanol. AimV (Invitrogen) itambahi pakon 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) pakon 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific). Penyangga pewarnaan sitometer aliran terdiri humbani 0,22μm saline penyangga fosfat na isaring (PBS; Invitrogen) na itambahi pakon 3% serum manusia AB na inaktifkon panas (Sigma). Penyangga pengayaan sel terdiri humbani 0,22μm PBS na isaring pakon itambahi pakon 0,5% serum AB manusia na inaktifkon panas (Sigma-Aldrich).
Bani media lengkap 37°C, sel-sel iwarnai marhitei 10 nM MT DR pakon 100 μM 2-NBDG sadokah 30 menit. Dob ai, sel-sel ai iwarnai marhitei pewarna viabilitas eF506 bani suhu 4°C sadokah 15 menit. Suspensihon use sel-sel ai bani FC Block (eBioscience) pakon Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), encerhon bani flow cytometer staining buffer (domu hubani petunjuk pabrik), dob ai inkubasi ma ai 10 menit bani suhu kamar. Warnai sel-sel ai marhiteihon sada set antibodi (Tabel S2) ibagas penyangga pewarnaan sitometri aliran bani suhu 4°C sadokah 20 menit. Suspensihon use sel-sel ai bani penyangga pewarnaan flow cytometry (Cytek Aurora; konfigurasi 3L-16V-14B-8R) paima i analisis. Pakei ma SpectroFlo pakon FlowJo V10 laho menganalisa data bilangan sel, pakon pakei ma GraphPad Prism 8 laho mambahen data ai. Intensitas fluoresensi median (MFI) 2-NBDG pakon MT DR i log-normalisasi, dob ai tes t na marpasangan ipakei laho analisis statistik laho mamparhitungkon pasien na sosok. Padaoh haganup populasi na hurang humbani 40 peristiwa humbani analisis; masukkon ma nilai LKM 1 bani nilai negatif paima mambahen analisis statistik pakon visualisasi data.
Ase boi itambahi strategi gating manual panel proses na i atas, ipakei hanami ma anotasi lengkap marhitei pohon pembatasan bentuk (FAUST) (21) laho otomatis mambere sel hubani populasi dobkonsi ipadaoh sel na matei i FlowJo. Hanami secara manual mangatur output laho padomuhon populasi na songon na salah alokasi (padomuhon PD1+ pakon sel tumor PD1) pakon populasi na ipertahankon. Ganup sampel marisi rata-rata lobih humbani 2% sel, bani total 11 populasi.
Sentrifugasi kepadatan gradien Ficoll ipakei laho mamisahkon PBMC humbani produk pemisahan leukosit (STEMCELL Technologies). CD8 + T sel isolasi humbani PBMC mamakei CD8 MicroBeads (Miltenyi) pakon iperluas bani media na lengkap mamakei TransAct (Miltenyi) sadokah 2 minggu mangihutkon petunjuk pabrik. Sel-sel ai ipaturut jongjong 5 ari ibagas media na lengkap na marisi IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), dob ai irangsang use marhitei TransAct. Bani ari 7, mangihutkon petunjuk ni pabrik, CD45 MicroBeads (Miltenyi) ni jolma ipakei laho pabanggalhon sel ibagas tolu putaran na marturut-turut. Sel-sel ai ibagi gabe aliquot untuk analisis sitometri aliran (songon na dob ipatugah i atas), pakon sajuta sel ibagi tolu hali untuk analisis LC-MS/MS. Sampel ai iproses marhitei LC-MS/MS songon na ipatugah i toruh on. Iperkirahon hanami do nilai metabolit na hurang marhiteihon bilangan ion 1.000. Ganup sampel inormalhon marhiteihon bilangan ion total (TIC), iubah secara logaritmik pakon inormalhon secara otomatis i MetaboAnalystR paima i analisis.
Suspensi sel tunggal humbani ganup pasien icairkon janah isaring marhitei filter 40 μm gabe media na lengkap (songon na dob ipatugah i atas). Domu hubani protokol pabrik, tolu putaran seleksi positif na marturut-turut marhitei pemisahan manik magnetik mamakei MicroBeads (Miltenyi) ipakei laho pabanggalhon sampel sel CD8+, CD4+ pakon CD45- (i atas es). Singkatni, sel-sel ai isuspensihon use bani penyangga pengayaan sel (songon na dob ipatugah i atas) dob ai ibilang. Sel-sel ai i inkubasi pakon manik CD8 ni jolma, manik CD4 ni jolma atap manik CD45 ni jolma (Miltenyi) bani suhu 4°C sadokah 15 menit, dob ai icuci pakon penyangga pengayaan sel. Sampel ai ipadas marhitei kolom LS (Miltenyi), dob ai ipatumpu ma pecahan positif pakon negatif. Ase boi mangurangi panorang pakon memaksimalhon langkah pemulihan sel, CD8-fraksi ipakei bani putaran paduahon pengayaan CD4+, pakon CD4-fraksi ipakei bani pengayaan CD45-selanjutni. Simpan ma larutan ai i atas es sadokah proses pemisahan.
Laho pasirsirhon sampel laho analisis metabolit, sel-sel ai iburihi sahali marhitei larutan garam na borgoh songon es, anjaha 1 ml metanol 80% itambahkon hubani ganup sampel, dob ai i-vortex janah i-snap frozen ibagas nitrogen cair. Sampel-sampel ai ibahen tolu siklus beku-cair janah isentrifugasi bani 14.000 rpm sadokah 15 menit bani 4°C. Supernatan na marisi metabolit ai iuapkon ronsi kering. Metabolit ai ilarutkon use ibagas 50 μl asam formik 0,03%, iputar ase marcampur, dob ai isentrifugasi laho padaohkon sisa-sisa.
Ekstrak ma metabolit songon na dob ipatugah i atas. Pindahkon supernatan hubani botol kromatografi cair berkinerja tinggi untuk penelitian metabolomik. Manggunahon protokol perlakuan acak laho mangubati ganup sampel marhiteihon bilangan sel na sarupa laho mancegah efek batch. Ibahen hanami do penilaian kualitatif bani metabolit global na dob iterbitkon hinan bani AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50). Analisis kromatografi pakon integrasi luas puncak ibahen mamakei perangkat lunak MultiQuant versi 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Hitungan ion 1000 ipakei laho mambahen perkiraan nilai metabolit na hurang, pakon TIC ni ganup sampel ipakei laho mangetong luas puncak na dob inormalhon humbani ganup metabolit na tardeteksi laho papintorhon parubahan na ibahen analisis instrumental humbani pemrosesan sampel. Dob TIC inormalhon, MetaboAnalystR(51) (parameter bawaan) ipakei bani konversi logaritmik pakon penskalaan garis norma otomatis. Igunahon hanami PCA pakon paket R vegan laho mambahen analisis eksploratif perbedaan metabolom antara jenis sampel, pakon mamakei analisis redundansi parsial laho menganalisa pasien. Manggunahon metode Ward laho mambahen dendrogram peta panas laho mangkelompokkon jarak Euclidean antara sampel. Igunahon hanami limma (52) bani kelimpahan metabolit na dob standar laho mangindahi metabolit na marbeda-beda bani ganup jenis sel pakon lingkungan mikro. Ase boi ipermudah penjelasan ai, ipakei hanami ma parameter rata-rata kelompok laho manontuhon model, pakon mamingkiri jenis sel i lingkungan mikro sebagai tiap kelompok (n = 6 kelompok); bani tes signifikansi, hanami mambahen tolu pangukuran na mangulang bani ganup metabolit Ase ulang terjadi replikasi na lepak, pasien imasukhon gabe hambatan bani desain limma. Ase boi mamareksa perbedaan metabolit antara pasien na berbeda, hanami menyesuaihon model limma na memasukkon pasien secara tetap. Ibaritahon hanami do signifikansi kontras na dob itontuhon hinan antara jenis sel pakon lingkungan mikro Padj <0,05 (koreksi Benjamini-Hochberg).
Dobkonsi pengayaan kekuatan mamakei Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% viabilitas), sekuensing transkriptom sel tunggal ibahen bani total sampel ascites beku na manggoluh pakon tumor mamakei protokol ekspresi gen 10x 5′. Lima kasus na martumor pakon ascites na sarupa ipareksa, hassi pe rendah ni viabilitas humbani sada sampel tumor mambahen lang boi masuk. Ase boi dapot buei pilihan pasien, ipadomu hanami ma sampel ni ganup pasien bani jalur kontroler kromium 10x, anjaha ipareksa hanami ma ianan ascites pakon tumor secara terpisah. Dobkonsi ibahen sekuensing [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), genom Quebec; rata-rata 73.488 pakon 41.378 mambasa per sel untuk tumor pakon ascites masing-masing]], ipakei hanami CellSNP pakon Vireo (53) (berdasarkan CellSNP sebagai SNP manusia umum (VCF) na ibere GRCh38 ibere identitas donor. Igunahon hanami SNPRelate laho menyimpulhon identitas terdekat (IBS) status genotipe pasien (IBS) lang dihut sel na lang itetapkon pakon sel na itanda sebagai dupleks pakon donor na sosok antara sampel ascites pakon tumor (54). (2792 pakon 4183 sel humbani tumor pakon ascites, masing-masing) untuk analisis Igunahon hanami do clustering igraph (57) humbani jaringan tetangga terdekat na ibagihon (SNN) berdasarhon jarak Jaccard hubani sel-sel kluster marhitei ekspresi. sel-sel iartihon marhitei ekspresi CD8A pakon GZMA, lang dihut subkluster na mar-ekspresi protein ribosom na rendah. Iakses hanami do data na dob iterbitkon Izar et al.
PBMC ipisahon humbani produk pemisahan leukosit (STEMCELL Technologies) marhitei sentrifugasi kepadatan gradien Ficoll. Sel CD3 + isolasi humbani PBMC mamakei manik CD3 (Miltenyi). Anggo dong atap lang MNA, sel CD3+ iaktifkon marhitei CD3 na terikat bani piring (5μg/ml), CD28 na larut (3μg/ml) pakon IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Bani ari parpudi ekspansi, viabilitas (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) pakon proliferasi (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) dievaluasi marhitei flow cytometry. Evaluasi fungsi efektor marhitei na merangsang sel-sel marhitei PMA (20 ng/ml) pakon ionomycin (1μg/ml) marhitei GolgiStop sadokah 4 jam, pakon pantau CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4) , BioLegend) pakon TNFα-fluoresce insothianate (TCb1) BD). Rangsang qPCR pakon sel ChIP marhitei PMA (20 ng/ml) pakon ionomycin (1μg/ml) sadokah 4 jam. Supernatan ELISA ipatumpu paima pakon dob stimulasi pakon PMA (20 ng/ml) pakon ionomycin (1 μg/ml) sadokah 4 jam.
Ihutkon ma protokol ni pabrik laho mangisolasi RNA mamakei RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Manggunahon QIAshredder (QIAGEN) laho mambahen sampel gabe sada. Manggunahon kit RNA hubani cDNA berkapasitas tinggi (Thermo Fisher Scientific) laho mansintesis DNA pelengkap (cDNA). Manggunahon TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) laho mangukur ekspresi gen (domu hubani protokol ni pabrik) marhiteihon probe na i toruh on: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427555m1 (AOX1) Hs02786624_g1 [glyceraldehyde-3-phosphate off Hydrogen (GAPDH)] pakon Hs01010726_m1 (SLC22A2). Sampel-sampel ai idalankon bani sistem PCR real-time StepOnePlus (Biosistem Terapan) (Biosistem Terapan) bani pelat reaksi 96 sumur optik cepat MicroAmp (Biosistem Terapan) pakon film optik MicroAmp. Sagala nilai Ct na lobih humbani 35 ianggap domma i atas ambang batas deteksi janah itanda sebagai na lang boi ideteksi.
Bahen ma ChIP songon na dob ipatugah nongkan (58). Singkatni, sel-sel ai irawat marhitei formaldehida (konsentrasi akhir 1,42%) janah iinkubasi bani suhu kamar sadokah 10 menit. Pakei ma penyangga pembengkakan na itambahi (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl pakon 0,1% NP-40) i atas es sadokah 10 menit, dob ai isuspensihon use bani penyangga imunopresipitasi songon na dob ipatugah (58 ). Sampel ai dob ai i sonikasi marhitei siklus na i toruh on: 10 siklus (20 pulsa 1 detik) pakon panorang statis 40 detik. Inkubasi ChIP-grade immunoglobulin G (Teknologi Pensinyalan Sel; 1μl), histon H3 (Teknologi Pensinyalan Sel; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) pakon SP1 (Teknologi Pensinyalan Sel; 3μl) antibodi pakon sampel bani 4°CC goyang-goyang saborngin. Inkubasi ma manik-manik protein A (Thermo Fisher Scientific) pakon sampel bani suhu 4°C marhitei na igoyang-goyang lembut sadokah 1 jam, dob ai pakei ma manik-manik chelex (Bio-Rad) laho pabayakkon DNA, pakon pakei ma proteinase K (Thermo Fisher) laho pencernaan protein. Promotor TNFα ideteksi marhitei PCR: hu lobei, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; sebalikni, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp produk). Gambar-gambar ai iproduksi Image Lab (Bio-Rad) pakon iukur mamakei perangkat lunak ImageJ.
Supernatan kultur sel ipatumpu songon na dob ipatugah i atas. Penentuan ai ibahen domu hubani prosedur pabrik ni human TNFα ELISA kit (Invitrogen), human IL-2 ELISA kit (Invitrogen) pakon human IFN-γ ELISA kit (Abcam). Domu hubani protokol pabrik, supernatan iencerkan 1:100 laho mangidah TNFα pakon IL-2, pakon 1:3 laho mangidah IFN-γ. Pakei ma EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) laho mangukur absorbansi bani 450 nm.
PBMC ipisahon humbani produk pemisahan leukosit (STEMCELL Technologies) marhitei sentrifugasi kepadatan gradien Ficoll. Sel CD3 + isolasi humbani PBMC mamakei manik CD3 (Miltenyi). Anggo dong atap lang MNA, sel CD3+ iaktifkon marhitei CD3 na terikat bani piring (5μg/ml), CD28 na larut (3μg/ml) pakon IL-2 (300 U/ml; Proleukin) sadokah 3 ari. Dob 3 ari, sel-sel ai ipatumpu janah icuci pakon 0,9% saline, dob ai pelet ai i bekuhon. Penghitungan sel ibahen marhitei flow cytometry (Cytek Aurora; konfigurasi 3L-16V-14B-8R) mamakei 123count eBeads.
Ekstrak ma metabolit songon na dob ipatugah i atas. Ekstrak na dob ikerangkon ai ibahen use bani konsentrasi 4000 setara sel/μl. Analisa sampel marhitei kromatografi fase terbalik (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) pakon kolom CORTECS T3 (2,1×150 mm, ukuran partikel 1,6-μm, ukuran pori 120-Å; #186008500, Waters). Spektrometer massa kutub (6470, Agilent), ija ionisasi semprotan elektro beroperasi ibagas mode positif. Fase mobile A aima 0,1% asam formik (ibagas H2O), fase mobile B aima 90% asetonitril, 0,1% asam formik. Gradien LC aima 0 ronsi 2 menit bani 100% A, 2 ronsi 7,1 menit bani 99% B, pakon 7,1 ronsi 8 menit bani 99% B. Dob ai seimbangkon ma use kolom ai pakon fase mobile A bani laju aliran 0,6 ml/min sadokah 3 menit. . Laju aliran 0.4ml/min, pakon ruang kolom ipagara das hubani 50°C. Manggunahon standar kimia murni MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) laho manotapkon panorang retensi (RT) pakon transformasi (RT = 0,882 menit, transformasi 1 = 137→94,1, transformasi 2 = 137→92 , Konversi = 13→77). Anggo haganupan na tolu transisi ai terjadi bani panorang retensi na sintong, transisi 1 ipakei laho mangukur laho memastikan spesifisitas. Kurva standar MNA (Toronto Research Chemical Company) ihasilhon marhitei onom pengenceran serial larutan stok (1 mg/ml) laho mandapotkon standar 0,1, 1,0, 10 pakon 100 ng/ml pakon 1,0 pakon 10μg/ml masing-masing cair. Batas deteksi aima 1 ng/ml, pakon respon linier antara 10 ng/ml pakon 10μg/ml. Ganup suntikan dua mikroliter sampel pakon standar ipakei bani analisis LC/MS, pakon sampel kontrol kualitas campuran idalankon tiap ualuh suntikan laho memastikan stabilitas platform analisis. Respon MNA humbani ganup sampel sel na irawat MNA ibagas rentang linier ni assay. Analisis data ibahen mamakei perangkat lunak analisis kuantitatif MassHunter (v9.0, Agilent).
Konstruksi αFR-CAR generasi paduahon ibuat humbani Song et al. (59). Singkatni, konstruksi ai marisi isi na i toruh on: urutan pemimpin CD8a, fragmen variabel rantai tunggal spesifik αFR ni jolma, engsel CD8a pakon wilayah transmembran, domain intraseluler CD27 pakon domain intraseluler CD3z. Urutan CAR na lengkap isintesis GenScript, dob ai ikloning hubani vektor ekspresi lentivirus generasi paduahon i hulu ni kaset ekspresi GFP na ipakei laho mangevaluasi efisiensi transduksi.
Lentivirus iproduksi marhitei transfeksi sel HEK293T [Koleksi Budaya Tipe Amerika (ATCC); ipatubuh bani media Eagle na imodifikasi Dulbecco na marisi 10% serum janin sapi (FBS) pakon 1% PenStrep, pakon mamakei vektor CAR-GFP pakon plasmid kemasan (psPAX2 pakon pMD2.G, Addgene) mamakei lipofection amine (Sigma-Aldrich). Supernatan na marisi virus ipatumpu 48 pakon 72 jam dob transfeksi, isaring, pakon ikonsentrasihon marhitei ultrasentrifugasi. Simpan ma supernatan virus na dob ipekat bani -80°C ronsi transduksi.
PBMC ipisahon humbani produk pemisahan leukosit donor na sehat (STEMCELL Technologies) marhitei sentrifugasi kepadatan gradien Ficoll. Manggunahon CD8 microbeads seleksi positif (Miltenyi) laho mangisolasi sel CD8+ humbani PBMC. Merangsang sel T marhitei TransAct (Miltenyi) pakon bani media TexMACS [Miltenyi; itambahi pakon 3% serum jolma na inaktifkon panas, 1% PenStrep pakon IL-2 (300 U/ml)]. Dua puluh ompat jam dobkonsi stimulasi, sel T itransduksi marhitei lentivirus (10 μl supernatan virus pekat per 106 sel). 1 ronsi 3 ari dobkonsi transduksi bani Cytek Aurora (bani FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), evaluasi ma ekspresi GFP ni sel-sel ai laho patuduhkon efisiensi transduksi saotikni 30%.
Sel CAR-T ikulturhon sadokah 24 jam i Immunocult (STEMCELL Technologies; itambahi 1% PenStrep) ibagas kondisi na i toruh on: lang irawat, irawat 250 μM adenosin atap 10 mM MNA. Dobkonsi praperawatan, sel CAR-T icuci pakon PBS janah ipadomu pakon 20.000 sel SK-OV-3 [ATCC; bani media McCoy 5A (Sigma-Aldrich) na itambahi 10% FBS pakon 1% PenStrep bani 10: Rasio efektor hubani target 1 iperkuat ibagas tolu hali bani media Immunocult na itambahi. Sel SK-OV-3 pakon sel SK-OV-3 na ilisis pakon saponin digitalis (0,5mg/ml; Sigma-Aldrich) ipakei sebagai kontrol negatif pakon positif, masing-masing. Dob 24 jam ko-kultivasi, supernatan ipatumpu janah laktat dehidrogenase (LDH) iukur domu hubani petunjuk pabrik (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Supernatan LDH iencerkan 1:50 bani penyangga LDH. Persentase pembunuhan iukur mamakei rumus na i toruh on: persentase pembunuhan = persentase koreksi / tingkat pembunuhan maksimal x 100%, ija persentase koreksi = ko-kultur-sel T tumang, pakon tingkat pembunuhan maksimal = kontrol positif-kontrol negatif.
Songon na dob ipatugah bani teks atap bahan pakon metode, pakei ma GraphPad Prism 8, Microsoft Excel atap R v3.6.0 laho mambahen analisis statistik. Anggo buei sampel na ipatumpu humbani pasien na sarupa (misalni ascites pakon tumor), ipakei hanami ma tes t na marpasangan atap pe imasukhon hanami pasien ai sebagai efek acak bani model linier atap umum na sosok. Bani analisis metabolomik, tes kepentingan ibahen ibagas tolu hali.
Anggo dong bahan tambahan bani artikel on, boi do ididah nasiam http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
On ma sada artikel akses terbuka na ibagihon mangihutkon syarat-syarat Lisensi Atribusi-Non-Komersial Creative Commons, na mangijinkon penggunaan, distribusi pakon reproduksi bani media aha pe, asal ma penggunaan akhir lang untuk keuntungan komersial pakon premisni aima anggo karya aslini domma sintong. Referensi.
Catatan: Hanami pitah mangindo ase nassiam mambere alamat email nassiam ase halak na isaranhon nassiam hu halaman on mambotoh anggo nassiam sihol mangidah email ai janah lang spam. Lang ra hanami manangkap alamat email.
Sungkun-sungkun on ipakei laho manguji atap na ham do pengunjung pakon mancegah pengiriman spam otomatis.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. Dephardini (R.R. Russell), Dephardnis. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA berkontribusi hubani penekanan kekebalan sel T pakon mewakili target imunoterapi na berpotensi untuk pengobatan kanker ni jolma.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. Dephardini (R.R. Russell), Dephardnis. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA berkontribusi hubani penekanan kekebalan sel T pakon mewakili target imunoterapi na berpotensi untuk pengobatan kanker ni jolma.
©2021 Asosiasi Amerika untuk Kemajuan Sains. haganup hak ipartahankon. AAAS aima mitra ni HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef pakon COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.